中药对幽门螺杆菌的体外联合抗菌实验
【摘要】 目的 研究黄连、乌梅、蜂胶对幽门螺杆菌的体外联合抗菌作用。方法 应用棋盘法，以琼脂平板法测定两两组合的不同浓度中药提取物对Hp的最低抑菌浓度，部分抑菌浓度(FIC)指数并判定联合效应。结果 黄连与蜂胶联合应用后，其FIC指数为0.13(＜0.5)；黄连与乌梅联合应用后，其FIC指数为0.75(＞0.5)；乌梅与蜂胶联合应用后，其FIC指数为0.19(＜0.5)。结论 黄连与蜂胶联合应用及乌梅与蜂胶联合应用，对Hp表现为协同作用，且乌梅与蜂胶联合应用协同作用较强；黄连与乌梅联合应用对Hp表现为相加作用；3种中药之间均无拮抗作用。
【关键词】 黄连 乌梅 蜂胶 幽门螺杆菌 联合抗菌实验
Combined Antibacterial Activity of Three Chinese Drugs Against Helicobacter Pylori
Abstract Objective：To study the combined antibacterial activity of Coptis chinensis，Dark Plum Fruit and Bee Propolispro against Helicobacter pylori(Hp)．Methods The protocol was designed by checkboard method．The MICs of Coptis chinensis，Dark Plum Fruit and Bee Propolispro alone or in two-and-two combination against Hp were determined by agar plate method,and the FIC indexes was calculated for the evaluation of the combined effects．Results When Coptis chinensis combined with Bee Propolispro，the FIC index was 0.13(＜0.5) but was 0.75(＞0.5)when combined with Dark Plum Fruit；The FIC index was 0.19(＜0.5)when Dark Plum Fruit combined with Bee Propolispro．Conclusion Both Coptis chinensis in combination with Bee Propolispro or Dark Plum Fruit in combination with Bee Propolispro had synergistic action on Hp．with the latter showing more potent synergistic action．Coptis chinensis combined with Dark Plum Fruit Ceorgi had additivity against Hp．No antagonistic actions were noted in Coptis chinensis，Bee Propolispro and Dark Plum Fruit．
Key words:Coptis chinensis；Dark Plum Fruit；Bee Propolispro；Helicobacter pylori(Hp)；combined drug susceptibility test
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是由Warren和Marshall于1982年首次从慢性活动性胃炎患者胃窦黏膜活检组织中分离出来并培养成功的，目前认为该菌与慢性胃炎、消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴样组织(MALT)恶性淋巴瘤以及肠型胃癌密切相关，WHO于1994年将其列为胃癌的I类生物致癌因子［1］。据调查，Hp感染在世界范围内广泛存在，世界平均感染率为50%左右，我国各地人群中的Hp感染率(成人)均在50%以上。西医采用以抗生素为主的三联、四联疗法Hp感染，但随着抗生素的使用，临床上观察到耐药菌株也越来越多。中医药治疗疾病有其独到之处，在注重局部病变的同时，更注重整体的调节，加上中药组方变化大，可供选择的药物多，其优势逐渐被人们认同。本研究考察了3种传统中药对Hp的体外抗菌作用。选用棋盘法测定其单独及联合药敏实验时各药物的最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)，以部分抑菌浓度(Fractional Inhibitory Concentration,FIC)指数评价药物的体外联合抗菌效应，为研制抗Hp新的中药组方提供实验依据。
1 材料
1.1 Hp菌株
本研究采用的Hp菌株为国际统一的SS1(Sydney Strain1)菌株，经鉴定cagA(+)和VacA(+).由河北医科大学中医学院微生物室提供。
1.2 培养基［2］
固体培养基为改良Skirrow选择性培养基，即在1000 ml改良Skirrow琼脂基础中加入抗生素混合液，使终浓度为四环素(TMP)5 mg／L，万古霉素10 mg／L，多粘菌素B 2 500U／L，并加入50 ml脱纤维冻融兔血。改良Skirrow琼脂基础和布氏肉汤均为北京陆桥技术有限责任公司产品。
2 方法
2.1 实验药液制备
称取黄连、乌梅、蜂胶3种中药，按重量比加10倍的蒸馏水浸泡30 min后，用文火煎熬30 min，倒出煎液，药渣再加等量蒸馏水煎熬30 min，2次煎液合并，3 500r／min离心15 min，倒出上清液，蒸发浓缩成含生药量1 g／mL浓度的药液。以最少量的二甲基亚砜溶剂溶解后，使其母液浓度分别为100 mg/mL、50 mg/mL、50 mg/mL.
2.2 菌液的制备
将培养3 d的Hp菌株用无菌生理盐水洗下后，配成布氏肉汤菌悬液，再用标准比浊管比浊，校正菌液浓度，使其菌液浓度相当于1×108(Colony Forming Units,CFU)/mL.
2.3 MIC的测定［3,4］
将上述3种药物的母液以二甲基亚砜倍比稀释，得到以下7种浓度药液：黄连（100、50、25、12.5、6.25、3.13、1.57 mg/mL）、乌梅（50、25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78 mg/mL）、蜂胶（50、25、12.5、6.25、3.13、1.57、0.78 mg/mL）。按黄连+蜂胶、黄连+乌梅、乌梅+蜂胶3组药物两两配对，将每组配对药物的不同浓度药液按棋盘法设计，两两配比，每种中药液均加50 μL；再向每管中加入900 μL改良Skirrow选择性培养基，充分混合均匀，加入64孔平板培养皿中；再将配好的菌液分别在培养基上涂布5 μL，放人培养罐中（85%N2、10%CO2、5％O2），湿度保持在90％以上，充气10 min，37℃培养72 h后观察结果。以肉眼及显微镜观察细菌生长情况，记录单独应用3种药的MIC甲药单用、MIC乙药单用，并选择最佳组合效应时联合2种药各自的MIC甲药联合、MIC乙药联合，以FIC指数。
2.4 FIC指数的计算与判断
FIC指数=MIC甲药联合/MIC甲药单用+MIC乙药联合/MIC乙药单用。FIC指数=0.5时为协同作用；0.5＜FIC指数≤1时为相加作用；1＜FIC指数≤2时为无关作用；FIC指数＞2时为拮抗作用。
3 结果
3.1 黄连、乌梅、蜂胶单独应用和每两种中药联合应用对Hp的MIC（mg/ml）及FIC指数情况(见表1) 表1 3种中药单用及两两联合应用对Hp的MIC及FIC指数
3.2 黄连、乌梅、蜂胶每两种联合应用的最佳配比(见表2)
4 讨论
本实验选取黄连和黄芩并加入具有良好抗菌作用的蜂胶作为研究对象，考察单药及两两联合后的抗菌作用。表2 3种中药两两联合应用的最佳配比黄连（Coptis chinensis）具有清热燥湿、泻火解毒的功效,是我国中医临床胃肠道疾病的常用药之一。黄连抑菌的有效成分一般认为是小檗碱，其杀菌机制可能是小檗碱抑制细菌的生长与呼吸，抑制细菌的葡萄糖及糖代谢中间产物的氧化过程，特别是脱氧反应，从而杀灭细菌。乌梅为双子叶植物药蔷薇科植物梅的干燥未成熟果实，主要具有敛肺止咳，涩肠止泻，固崩止血，生津止渴，安蛔作用，主治久咳，虚热烦渴，久疟，久泻，痢疾，便血，尿血，血崩，蛔厥腹痛、呕吐，钩虫病［5］。
通过本实验可以得出以下结论：3种中药抗Hp的效果为黄连＞蜂胶＞乌梅；黄连与蜂胶、乌梅与蜂胶联用对Hp均呈现协同作用，且蜂胶与乌梅的联用显著增强了抗菌效果；而黄连与乌梅联用对Hp仅呈现相加作用。3种中药提取物之间均无拮抗作用。
综上所述，蜂胶对Hp有很好的抗菌活性，与其它药物联合抗Hp通常表现为协同作用。因此，在中药复方制剂治疗Hp阳性消化性溃疡时，加入蜂胶可能会起到更好的疗效。
【】
［1］中华医学会消化病学分会.对幽门螺杆菌若干问题的共识意见(2003.)［J］.中华医学杂志，2004，84(6)：522．
［2］谢献胜,王锋,陆桂平,等.幽门螺旋杆菌的培养与保存［J］.泰州职业技术学院学报，2006，6(1)：51-52.
［3］裴斐,王睿.磷霉素与替考拉宁对90株革兰阳性球菌的联合药敏研究［J］.中华感染学杂志，2004，14(11)：1 282-1 284．
［4］Eliopoulos GM. Moellering RC Jr. Antibootics in Laboratory Medicine［M］.4thed.New York:Williams&Wilkiins，1996：330．
［5］吴静,王克霞.中药制剂体外抑杀幽门螺杆菌的研究进展［J］.时珍国医国药,2006, l7(4):631-633.
