新城疫病毒合用中药黄芪诱生内源性干扰素的研究
【摘要】 目的 研究新城疫病毒（NDV）合用中药黄芪在小鼠体内诱生内源性干扰素-α及对小鼠的免疫调节作用。方法 实验分3部分，实验1：分别以NDV、黄芪及二者合用予小鼠口腔喷洒给药，连续10日后以ELISA法测定小鼠唾液中干扰素-α和SIgA的含量；实验2：分别以NDV、黄芪及二者合用予小鼠腹腔注射给药（黄芪灌胃方式给药），ELISA法测定给药10日后血清干扰素-α的含量；实验3：分为NDV、黄芪及二者合用的高、中、低三种剂量，给药方法同第二组，6天后MTT法测定脾脏NK细胞的活性。每组分别设置阴性对照。结果 NDV和黄芪口腔给药能升高小鼠唾液干扰素-α（35.54±10.20 IU/ml,5.69±1.35 IU/ml）和SIgA含量（68.88±15.47 ng/ml,44.32±9.87 ng/ml），腹腔给药能诱生血清干扰素-α（120.54±29.21 IU/ml,10.69±6.35 IU/ml），并能激活NK细胞活性(50.4％,32.1％)。NDV合用黄芪组的诱生效果远高于单独使用组（98.55±16.95IU/ml,101.31±27.59ng/ml,262.55±26.91IU/ml,75.6%），显示出较强的协同作用。结论 NDV合用黄芪能诱生小鼠内源性干扰素，并能发挥对小鼠SIgA和NK细胞的免疫调节作用。
【关键词】 新城疫病毒NDV 芪 内源性干扰素-α SIgA NK细胞
Abstract：Objective To study the induction of endogenous interferon-α(IFN-α) and immunological regulation of Newcastle Disease Virus(NDV)and Milkvetch Root(MR)combinating administrated in mice.Methods There were 3 parts.Part 1:the IFN-α and SIgA concentration in saliva were detected by ELISA after NDV and MR were sprinkled in mouse oral cavity for 10 days.Part 2:the level of IFN-α in serum were detected but the drug were intraperitoneal administrated.Part 3:the activity of NK cell in spleen were measured by MTT method after the same treatment as group 2 for 6 days.Results The concentration of IFN-α(35.54±10.20 IU/ml,5.69±1.35 IU/ml)and content of SIgA（68.88±15.47 ng/ml,44.32±9.87 ng/ml）in saliva had been promoted after NDV and MR administrated in oral cavity,and the serum level of IFN-α（120.54±29.21 IU/ml,10.69±6.35 IU/ml）had been induced and spleen NK cell(50.4％,32.1％)had been activated after it administrated in abdominal cavity.When NDV and MR combinating administrated,they synergistically enhanced the production of endogenous IFN-α and stimulated the immunological regulation, the detected data(98.55±16.95 IU/ml,101.31±27.59 ng/m,262.55±26.91 IU/ml,75.6%)were more higher than they were separated used(P＜0.05).Conclusion NDV combinated with MR used in mice showed a strong IFN-α inducing capacity,and then it could contributed the immunoregulation action on sIgA and NK cell.
Key words:Newcastle Disease Virus(NDV)；Milkvetch Root(MR)；endogenous IFN-α；SIgA； NK cell
干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的细胞因子，除具有广谱抗病毒作用外，还有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤作用。临床使用的干扰素多为基因工程产品，工艺复杂，价格昂贵，且副作用多，易产生自身抗体，疗效也越来越差［1］。使用诱导剂诱生机体产生内源性干扰素替代重组干扰素用于病毒性疾病的是一种值得推荐的选择，因为诱导剂价廉，效果稳定，副作用小。干扰素诱生剂的研究已有很多年，一些诱生剂药物也已用于临床。本实验目的在于考察新城疫病毒联用黄芪诱生小鼠内源性干扰素-α的能力，并观察其对小鼠口腔粘膜SIgA和脾脏NK细胞的免疫调节作用，以提供一种新的干扰素诱生方式。
1 材料与方法
1.1 实验药品
新城疫病毒（NDV）Lasota株：购自医学院医药生物技术研究所，在10日龄鸡胚尿囊腔传代，接种后72 h收获尿囊液，以鸡红细胞在血凝板上检测，终效价为1 280血凝单位（HAU）。黄芪（黄芪甲甙，西安鸿生生物技术有限公司出品）。
1.2 试剂与仪器
0.01%匹罗卡品注射液购自成都市第一人民；羊抗鼠IgA抗体,生物素标记羊抗鼠IgA抗体,亲和素-酶及小鼠IgA标准品均购自美国Sigma公司；Yac-1细胞为四川大学华西医学中心免疫室传代培养的细胞株；小鼠干扰素-α定量检测试剂盒购自北京博奥森科技有限公司。酶标仪（BIO-RAD680）；洗板机（BIO-RAD 1575）；超净台（ESCO公司产品）；二氧化碳培养箱(JOUAA公司产品)；倒置显微镜(LEICA公司产品)；96孔培养板（NUNCTM公司产品）；1000 μl、200 μl、20 μl微量加样器（EPPENDORF产品）。
1.3 试验动物
5～8周龄，雌雄各半，SPF级，由四川大学华西动物实验中心提供。
1.4 NDV和黄芪口腔给药诱生局部干扰素及SIgA实验 将32只Balb/c小鼠分为4组，分别为阴性对照组（生理盐水NS），黄芪组（黄芪甲甙9 μg/鼠），NDV组（NDV 50 HAU/鼠），复方组（NDV 50 HAU/鼠＋黄芪甲甙9 μg/鼠），每组8只小鼠。NDV和黄芪甲甙分别用生理盐水配制成所需剂量，以口腔喷雾方式给药，每日上、下午各1次,连续给药10天。
于给药后第14天取各组小鼠唾液。方法是：0.01%匹罗卡品腹腔注射，注射量为300 μl/只，3分钟后取口腔流出的唾液，置于0.5 ml EP管中，-20℃中保存。用小鼠干扰素-αELISA试剂盒测定各组小鼠唾液中干扰素-α的含量，依说明书中操作步骤进行；以［2］的ELISA检测方法检测各组小鼠唾液中SIgA含量。
1.5 NDV和黄芪腹腔给药诱生内源性干扰素实验
动物分组同上。黄芪甲甙用生理盐水配制成悬液状后灌胃给药，每日2 次；NDV液体剂腹腔注射给药，每日1次，连续给药10日。于给药后14天摘眼球采血，离心（4 000 r/min），取上清。用小鼠干扰素-αELISA试剂盒测定各组小鼠血清中干扰素-α的含量。
1.6 NDV和黄芪激活小鼠NK细胞实验
将Balb/c小鼠分6组，每组8只，分别为阴性对照组（NS），黄芪组（黄芪甲甙9 μg/鼠），NDV组（NDV 50 HAU/鼠），复方组1（NDV 50 HAU/鼠＋黄芪甲甙0.9 μg/鼠），复方组2（NDV 50 HAU/鼠＋黄芪甲甙9 μg/鼠）和复方组3（NDV 50 HAU/鼠＋黄芪甲甙90 μg/鼠）。给药方法同1.5，连续给药6天后测定各组小鼠脾脏的NK细胞活性，方法参见文献［3］。
1.7 统计分析
采用SPSS10.0统计软件对各组数据进行统计学处理，1.4和1.5实验用方差分析，1.6实验用率检验，α=0.05.
2 结果
2.1 NDV和黄芪对小鼠口腔干扰素-α和SIgA的诱生效果 各组小鼠唾液中内源性干扰素-α和SIgA含量见表1.表1 各组小鼠唾液中内源性干扰素-α和SIgA含量 表1的结果显示，单用黄芪即能诱导内源性干扰素-α的产生，但诱导能力较弱，SIgA含量的升高不明显；NDV诱导干扰素-α和SIgA的效果显著；黄芪与NDV合用诱生能力更强，产生协同效应，远高于各自单独使用（P＜0.05）。
2.2 NDV和黄芪对全身性内源性干扰素的诱生作用 各组小鼠血液中内源性干扰素-α含量见表2.表2 各组小鼠内源性干扰素-α生成量 表2结果显示，黄芪组、NDV组和黄芪与NDV合用组诱生的全身性内源性干扰素分别为小鼠血清干扰素-α基础值的2倍、20倍和50倍以上，同样可观察到黄芪与NDV合用产生的协同效应。
2.3 NDV合用黄芪对小鼠NK细胞的激活作用
各组小鼠的NK细胞活性如图1所示。单用黄芪组有微弱的激活NK细胞活性效应，但与对照组比较无显著性差异（P＞0.05），NDV组激活NK细胞活性显著（P＜0.05），而NDV联用3种剂量的黄芪激活小鼠NK细胞的效果都较强，而且3个复方组之间无显著性差异（P＞0.05）。
3 讨论
干扰素是某些细胞在受到外源微生物感染的刺激下诱导产生的一种细胞因子，而病毒感染是诱导干扰素产生的最主要原因。其中，新城疫病毒Lasota株是较好的干扰素诱导剂［4］，该毒株是从新域疫病毒株中筛选出的一株减毒株，属副粘液病毒，宿主是鸡和鸭，对人无致病性，诱导干扰素能力很强。我国最早用此毒株作为诱导剂用于人白细胞干扰素的生产。干扰素诱导剂还有：由细胞产生或人工合成的双链RNA（简称聚肌胞）、细菌产物如真菌多糖、多聚物如多核苷酸、某些植物药如黄芪、细胞有丝分裂素如PHA、ConA等。目前已上市的干扰素诱生剂成品药有乙氨芴酮胶囊、聚肌胞甘酸注射液、爱维治片、聚合3种干扰素诱导剂的新品“干诱生”、香菇多糖胶囊等［5］。
本研究中，小鼠口腔局部喷洒NDV，在唾液中可测得小鼠内源性干扰素-α，腹腔注射NDV，可在血液中测得干扰素-α，显示出明显的干扰素诱生能力。在合用黄芪后，诱导干扰素的能力可成倍的提高，而单独使用黄芪诱生能力较差。由此可看出，NDV为主诱生剂，黄芪同NDV合用具有协同作用。
由于有内源性干扰素的生成，可以发挥其自身的免疫调节作用。干扰素可以诱导口腔粘膜的SIgA，能激活脾脏的NK细胞活性，发挥对抗外来微生物感染的非特异免疫反应［6］，本研究也证明了这一点。单独使用黄芪组诱生干扰素能力较弱，对SIgA和NK细胞的免疫调节也不明显的；而NDV能诱生大量干扰素，SIgA的含量和NK细胞的活性也大大提高。
上呼吸道粘膜免疫系统由舌、腭扁桃体、口腔及鼻咽部的咽扁桃体和粘膜下淋巴滤泡组成，当病毒感染这些部位时会激发其淋巴细胞产生并分泌干扰素。干扰素参与针对病毒感染的B和T细胞应答，发挥调节作用，在刺激产生分泌型IgA前体细胞之后，在粘膜固有层和腺体导致浆细胞分化并产生SIgA［7,8］。SIgA在保护机体免受粘膜表面的微生物侵袭方面起着非常重要的作用，SIgA可阻止病原微生物粘附于粘膜上皮细胞表面，对由食物摄入或空气吸入的某些抗原物质具有封闭作用，使这些抗原游离于分泌物，便于排除或使抗原物质局限于粘膜表面，不致进入机体，从而避免某些超敏反应的发生。SIgA可与溶菌酶、补体共同作用，引起细菌溶解。存在于粘膜局部的特异性SIgA不需要补体参与，即能中和消化道、呼吸道等部位的病毒，使其不能吸附于易感细胞上。
口腔、鼻腔粘膜部位是大多数病毒性传染病入侵的门户，也是上呼吸道病毒侵袭、繁殖与发病部位，因此，NDV和黄芪口腔途径给药诱生上呼吸道产生内源性干扰素，可发挥对上呼吸道病毒感染的和预防作用，如普通感冒、流感及其他病毒性疾病。腹腔注射等全身性给药诱导大量内源性干扰素可用于病毒性肝炎等其他系统疾病的治疗。
在NK细胞激活实验中，复方组的NK细胞活性不随黄芪含量的增多而增高，推测黄芪对NDV产生的协同效果可能是起到免疫佐剂的作用，其详细机理有待进一步论证。
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