环酯红霉素干混悬剂微生物限度检查方法的建立

【摘要】  目的 通过对环酯红霉素干混悬剂进行验证试验，确定适宜的微生物限度检查的方法。方法及结果 细菌采用薄膜过滤法，当冲洗量为1 000 mL 时可消除抑菌作用；真菌采用常规法检验，人工污染真菌的回收率均高于70%。结论 环酯红霉素干混悬剂微生物限度检查细菌应采用薄膜过滤法，冲洗量为1 000 mL ；真菌采用常规法检验，大肠埃希菌采用薄膜过滤法，冲洗量为800 mL。

【关键词】  微生物限度检查方法 薄膜过滤法 常规法 抑菌作用

　环酯红霉素干混悬剂为新型大环内酯类抗生素，是红霉素的半合成衍生物，环酯化后的红霉素降低了血清蛋白结合率，提高了抗菌活性和降低了毒性；本品为广谱抗生素，其注册质量标准中未列微生物限度的检验方法。为此，本文对环酯红霉素干混悬剂的微生物限度的检查方法进行了验证试验。

　　1  试验材料

　　1.1  样品  环酯红霉素干混悬剂,批号：061101,规格：0.125 g/包，生产厂家： 海南澳美华制药有限公司。

　　1.2  菌种［1］  大肠埃希菌CMCC(B) 44102、枯草芽孢杆菌CMCC(B) 63501、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、白色念珠菌CMCC(F)98001、黑曲霉CMCC(F)98003 由药品生物制品检定所提供。

　　1.3  培养基  玫瑰红钠琼脂，批号：040929；营养琼脂，批号：060214；营养肉汤，批号：060117；真菌培养基，批号： 050103；胆盐乳糖培养基，批号： 060117 ，均由北京三药科技开发公司提供；MUG，批号：051207，由北京牛牛基因技术有限公司提供。

　　2  金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的验证［2，3］

　　2.1  菌液制备

　　2.1.1  取经37 ℃培养18～24 h的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草杆菌的肉汤培养物1 mL加9 mL盐水，10倍稀释至10-5 ～10-7，细菌数约为50～100  cfu/mL，做活菌计数备用。

　　2.1.2  取经25  ℃培养18～24 h的白色念珠菌真菌液体培养物1 mL加9  mL盐水,10倍稀释至10-5～10-6，细菌数约为50～100 cfu/mL，做活菌计数备用。

　　2.1.3  取经25  ℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加3～5 mL盐水洗下真菌孢子，吸取出菌液， 然后取1  mL 加9  mL盐水，10倍稀释为10-3，细菌数约为50～100 cfu/mL，做活菌计数备用。

　　2.2  供试品的制备  取本品10 g,溶于100 mL的pH7.0氯化钠?蛋白胨缓冲液中，作为1∶10供试液。

　　2.3  试验组  分别取1∶10供试液,以500 r/min离心5 min,，分别取上清液1 mL薄膜过滤，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液冲洗，每次100 mL，在最后一次冲洗液中分别加入试验菌少于100  cfu/mL金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌1 mL；过滤取出滤膜，分别贴于营养琼脂平皿中于30～35 ℃培养,每天观察结果，计数。

　　2.4  菌液组  测定每一菌株的试验菌数，采用平板菌落计数法。

　　2.5  供试品组  不加菌液，其他操作同试验组，测量样品本底菌数。

　　2.6  稀释剂对照组  取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，按试验组的冲洗量过滤，在最后一次冲洗液中逐一加入试验菌，取出滤膜分别接种于相应培养平皿中培养计数。

　　2.7  结果  采用薄膜过滤法测定的回收率结果见表1。结果表明，当冲洗量为1 000 mL时，可消除抑菌作用。

　　表1  薄膜过滤法验证试验结果（略）

　　Tab.1  Test  results of membrane filtration

　　3  黑曲霉菌和白色念珠菌的验证［2，3］

　　3.1  供试品的制备  取本品10 g,溶于100 mL的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成1∶10的供试液。

　　3.2  试验组  取2组平皿，每组2个，分别取1∶10供试液1 mL和50～100 cfu/mL试验菌株1 mL同时加入平皿中，立即倾注琼脂培养基,于24～28 ℃培养,每天观察结果,计数。

　　3.3  菌液组  测定每一菌株的试验菌数，采用平板菌落计数法。

　　3.4  供试品组  不加菌液，其他操作同试验组，测量样品本底菌数。

　　3.5  结 果  采用常规法测定的回收率结果见表2。结果表明黑曲霉菌和白色念珠菌的回收率均大于70%。

　　表2  常规法验证试验结果（略）

　　Tab.2  Test results of plate count method

　　4  控制菌大肠埃希菌检查方法验证［2，3］

　　4.1  供试品的制备  取本品10 g,溶于100 mL的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，以500 r/min离心5 min（10 mL/管），合并上清液作为1∶10的供试液。

　　4.2  试验组  取1∶10供试液10 mL,薄膜过滤，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液冲洗，每次100 mL，共冲洗8次, 在最后一次冲洗液中分别加入1 mL大肠埃希菌，过滤取出膜，培养于100 mL胆盐乳糖增菌液中,于 30～35 ℃培养24 h，观察结果。

　　4.3  阴性对照组  取1∶10供试液10 mL,薄膜过滤，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液冲洗，每次100 mL，共冲洗8次, 在最后一次冲洗液中分别加入1 mL金黄色葡萄球菌液，过滤，取出膜培养于100 mL胆盐乳糖增菌液中,于 30～35 ℃培养24 h,观察结果。

　　4.4  取上述培养物各0.2 mL接种至5 mLMUG培养基试管内培养，于5 h、24 h在365 nm的紫外灯下观察，同时用未接种的MUG培养基做本底对照。结果见表3。

　　表3  大肠埃希菌检查方法验证结果（略）

　　Tab.3  Validation test results of Escherichia coli

　　5  讨论

　　5.1  从表1结果可知，环酯红霉素干混悬剂细菌数检查采用薄膜过滤法，通过不同的冲洗量，测定人工染菌回收率，总冲洗量为800 mL时，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌回收率均低于70%，方法还是不可行；当总冲洗量为1 000 mL时，人工污染3株代表菌株，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的回收率均高于70%，符合药典微生物限度验证方法的要求，故可采用薄膜过滤法进行检验。

　　5.2  环酯红霉素干混悬剂为广谱抗生素，主要作用于细菌，从表2结果可知，采用常规法测定真菌和酵母菌数，人工污染2株代表菌株，白色念珠菌、黑曲霉回收率均高于70%，符合规定中国药典微生物限度验证方法的要求，所以真菌和酵母菌数验证方法首选常规法。

　　5.3  从表3结果可知，环酯红霉素干混悬剂的大肠埃希菌检查可采用薄膜过滤法，冲洗量为800 mL。

　　5.4  据上述结果，环酯红霉素干混悬剂微生物限度检查中的细菌数采用薄膜过滤法进行检查，即取本品10 g,置100 mLpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中，混匀，以500 r/min离心5 min，取上清液1 mL，照薄膜过滤法处理，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液为冲洗液，冲洗量为1 000 mL，真菌和酵母菌数采用常规检验，大肠埃希菌可用薄膜过滤法，冲洗量为800 mL。

【】
  　　［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部 ［S］.北京：化学出版社，2005：附录 79.

　　［2］ 应国红.18种中成药污染细菌的回收率试验［J］.江西中医学院学报，2005，17（3）：65.

　　［3］ 杜娟,范兵.三高茶的微生物限度检查方法验证研究［J］.中国药事，2006，20（3）：156.