凝胶色谱法测定注射用盐酸头孢吡肟中的高分子杂质

【摘要】  目的 建立测定注射用盐酸头孢吡肟中高分子杂质(头孢吡肟聚合物)的方法。方法 采用分子排阻凝胶色谱自身对照外标法进行定量，用葡聚糖凝胶G?10(40～120 μm)为填料，流动相A为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH=7.0)，流动相B为超纯水，流速为1.0 mL/min, 检测波长为254 nm。结果 注射用盐酸头孢吡肟的高分子杂质含量均小于0.5％。结论 本法快速、简便，可用于注射用盐酸头孢吡肟高分子杂质的质量控制。

【关键词】  盐酸头孢吡肟 凝胶色谱法 高分子杂质

　　Abstract:Objective  To establish a method for determining high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride  injection. Methods Quantification of high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection was determined by Sephadex G?10 column chromatography with external standard method. The mobile phase consisted of 0.1 mol／L phosphate buffer(pH7.0) and supper pure water．The flow rate was 1.0 mL／min and detection wavelength 254 nm. Results  The content of high molecular weight impurities in different batches of cefepime hydrochloride injection was less than 0.5％．Conclusion This method was sensitive and accurate for determining high molecular weight impurities in cefepime hydrochloride injection.

　　Key words: cefepime hydrochloride; sephadex G-10; high molecular weight impurities

　　注射用盐酸头孢吡肟（cefepime hydrochloride）是20世纪90年代上市的第四代头孢菌素，本品抗菌谱广，药效强。实验研究表明，控制产品中高分子杂质是减少β-内酰胺类抗生素过敏反应的重要途径之一 ［1］。《药典》2005年版采用凝胶色谱自身对照外标法定量测定β?内酰胺类抗生素中的聚合物，而盐酸头孢吡肟不能完全缔合，无法采用“自身”对照外标法定量，根据《中国药典》2005年版二部阿莫西林聚合物检验方法，可以用结构与研制产品类似，且能够完全缔合的其他药物制备对照品，进行自身对照外标法定量［2-3］。本文用与头孢吡肟结构及分子量相近的头孢噻肟作对照品，建立了测定注射用盐酸头孢吡肟中高分子杂质(头孢吡肟聚合物)的方法。

　　1  仪器与试药

　　1.1  仪器
        
　　DHL?A电脑恒流泵(上海泸西分析仪器厂)，UVD?680?2紫外检测仪(上海金达生化仪器厂)，HW?2000色谱工作站(南京色谱软件有限公司)。

　　1.2  试药
   
　　头孢噻肟对照品(批号130483-200102，中国药品生物制品检定所)；注射用盐酸头孢吡肟(批号060330、060731、060830，广州白云山天心药业股份有限公司)。
   
　　磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸、氢氧化钠均为分析纯；水为二次重蒸馏水；葡聚糖凝胶(Sephadex)G?10和蓝色葡聚糖2000为Amersham Bioscience公司产品。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件
       
　　色谱柱为玻璃色谱柱（40 m×1.5 cm），内填Sephadex G?10凝胶；流动相A为pH7.0的0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钠21.85 g和磷酸二氢钠6.08 g，加水1 000 mL，调pH值为7.0)，流动相B为超纯水；流速为1.0 mL/min；检测波长为254 nm。

　　2.2  系统适用性试验［4］
   
　　分别以流动相A、B为流动相，取0.1 mg/mL蓝色葡聚糖2000溶液200 μL注入色谱仪，理论塔板数按蓝色葡聚糖2000峰分别为1 968、1 639，拖尾因子分别为1.7、1.1，在两种流动相系统中蓝色葡聚糖2000保留时间的比值为1.01，对照溶液主峰和供试品溶液中聚合物与相应色谱系统中蓝色葡聚糖2000峰的保留时间的比值都在0.93～1.07之间，另以流动相B为流动相，精密量取对照溶液200 μL，连续进样5次，峰面积的相对标准偏差为0.35％。

　　2.3  标准曲线绘制
   
　　取头孢噻肟对照品约0.25 g置50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分别置10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别取上述溶液各200 μL，记录色谱图，以质量浓度(ρ)为横坐标， 峰面积（A）为纵坐标进行线性回归，回归方程为：ρ=8.714×106A+31788(n=5,r=0.9998)。实验表明，在0.025～0.4 mg/mL质量浓度范围内与峰面积线性关系良好。

　　2.4  精密度和稳定性试验
   
　　配制每1 mL含100 μg的头孢噻肟对照溶液，精密量取200 μL注入色谱仪，连续进样5次，峰面积的RSD为0.35％。将测定溶液放置1、2、4 h，分别测定峰面积，计算峰面积的RSD为0.27％。

　　2.5  检测灵敏度试验
   
　　取头孢噻肟对照品适量，精密称定，用水稀释制成一系列浓度的溶液，精密量取上述溶液200 μL注入色谱仪，以流动相B为流动相进行测定，记录色谱图。最小检测限(S/N＝3)为0.025 mg/mL，最小定量限(S/N＝10)为0.076 mg/mL。

　　2.6  重复性试验
   
　　取同一批号样品依法重复测定6次，得高分子杂质含量分别为0.09％，0.1％，0.1％，0.1％，0.1％，0.1％，RSD为4.15％。实验表明方法的重复性良好。

　　2.7  样品的测定
   
　　取头孢噻肟对照品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1 mL中约含0.2 mg的对照溶液。取供试品适量约相当于头孢吡肟0.2 g ，精密称定，置10 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，立即精密量取200 μL注入色谱仪，以流动相A为流动相进行测定，记录色谱图，见图1。另精密量取对照溶液200 μL注入色谱仪，以流动相B为流动相，同法测定。按外标法以峰面积计算，含头孢吡肟聚合物以头孢吡肟计算(头孢噻肟:头孢吡肟＝1.0∶0.94)，3个批号（060330、060731、060830）的样品测定结果分别为0.3%、0.2%和0.1%。

　　图1  注射用盐酸头孢吡肟高分子杂质检查图谱（略）

　　Fig.1  Chromatograms of high molecular weight impurities in cefepime  hydrochloride injection
   
　　3  讨论
      
　　高分子杂质会随样品放置时间的延长而增加，而高分子杂质是引起β?内酰胺类抗生素过敏反应的主要原因之一，故有必要对其进行检测。《药典》2005年版标准增强了对高分子杂质检测的要求。本方法按照《中国药典》2005年版标准要求进行研究检测，经试验结果表明，本方法灵敏、准确、简便，可用于注射用盐酸头孢吡肟的质量控制。

【】
  　　［1］ 李哲媛，李玉凤，范兵. 阿莫西林中高分子杂质的测定与质量分析［J］. 中国应用药学杂志，2006，23(4)：326-327.

　　［2］ 霍秀敏.β?内酰胺类抗菌素分子杂质的研究［J］.药品评价，2005，2(5)：324-326.

　　［3］ 胡昌勤，金少鸿.自身对照外标法定量测定β?内酰胺类抗菌素中的高分子杂质［J］.中国抗生素杂志，1997，22(1)：23-27.

　　［4］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部［S］.北京:化学出版社,2005：134-149.