RP?HPLC法测定脑得生片中羟基红花黄色素A的含量
【摘要】 目的 采用反相高效液相色谱法建立了测定脑得生片中羟基红花黄色素A含量的方法。方法 采用超声波法提取，经大孔树脂HP20纯化后，以反相高效液相色谱法测定羟基红花黄色素A的含量。色谱柱为Phenomenex Luna C18（5 μm，3.9 mm×150 mm），流动相为甲醇?乙腈?0.7%磷酸溶液(体积比21∶5∶74)，流速1 .0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长403 nm。结果 羟基红花黄色素A在1.22～9.15 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数为0.9998。平均加样回收率为100.93%，RSD为1.73%。结论 该方法准确、专属性强、重复性好，可用于测定脑得生片中羟基红花黄色素A的含量。
【关键词】 脑得生片 羟基红花黄色素A 含量测定 大孔树脂
脑得生片由三七、川芎、红花、葛根和山楂等组成，具有活血化瘀、疏通经络、醒脑开窍之功效［1］。2005年版《药典》仅以三七皂苷为定量指标对脑得生片进行质量控制［1］。而红花作为该药的重要组成部分之一，其主要有效成分羟基红花黄色素A (hydroxyl safflor yellow A, HSYA)具有扩张冠状动脉、缓解心肌缺血和抗凝血、抑制血栓形成等作用［2, 3］，在脑得生片脑血管疾病方面起重要作用。目前，关于脑得生片中红花成分的质量控制方法研究尚未见报道。本文建立了测定脑得生片中HSYA含量的RP?HPLC法，为进一步有效控制脑得生片的质量提供了实验依据。
1 仪器与试药
1．1 仪器
Waters 2695型高效液相色谱仪；Waters 2996二极管阵列检测器；Waters Empower色谱工作站；KQ?100超声波清洗器(100 W，昆山市超声仪器有限公司)；RE52CS旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
1．2 试药
甲醇和乙腈为色谱纯，屈臣氏双蒸水，其他试剂均分析纯； HP20型大孔树脂（Diaion，日本三菱化学公司）；羟基红花黄色素A（批号：111637-200502 中国药品生物制品检定所）；脑得生片（规格：3 g/片，批号分别为：20070302、20070312、20070322，广东药学院中药学院）。
2 方法与结果
2．1 色谱条件与系统适用性试验
Phenomenex Luna C18 (5 μm，3.9 mm×150 mm)色谱柱；流动相为甲醇?乙腈?0.7%磷酸(体积比21∶5∶74)；检测波长为403 nm；流速为1.0 mL·min-1；柱温为30 ℃。理论塔板数以羟基红花黄色素A不低于3 000；分离度大于1.5；重复性RSD为1.58%；羟基红花黄色素A峰的拖尾因子为1.03。色谱图见图1。
图1 羟基红花黄色素A对照品（A），阴性对照（B），供试样品(C)色谱图（略）
Fig.1 HPLC chromatograms of reference substance(A), negative reference substance HSYA (B) and sample（C）
2.2 溶液的制备
2．2.1 对照品溶液的配制
取羟基红花黄色素A对照品1.0 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入30%（体积分数）甲醇5 mL，超声溶解后，用30%（体积分数）甲醇定容至刻度。精密移取5.0 mL，加30%（体积分数）甲醇稀释至10.0 mL，揺匀，制得质量浓度为0.061 mg·mL-1的对照品溶液，密封保存，备用。
2．2.2 供试品溶液的制备
取脑得生片20片，去糖衣，研细。取1.0 g，精密称定置具塞锥形瓶中，加入30%（体积分数）乙醇50 mL，超声提取30 min，滤过，滤液于50 ℃下减压回收至无醇味，然后加纯净水20 mL分散，水分散液过HP20型大孔树脂柱(内径1.5 cm，长10 cm)，以50 mL水洗脱，弃去水液。再用30%（体积分数）乙醇洗脱，收集50 mL，旋蒸仪浓缩至干，加30%（体积分数）甲醇溶解转移至25 mL容量瓶中，用30%（体积分数）甲醇定容至刻度，揺匀，即得。
2.2.3 阴性对照溶液的制备
按脑得生片处方比例制成不含红花的阴性对照样品，依“2.2.2”项方法制得阴性对照溶液。
2．3 阴性对照试验
分别取供试品溶液，阴性对照溶液及对照品溶液，以10 μL进样量，在色谱条件下进行测定，结果表明，阴性无干扰，见图1。
2．4 线性范围
精密吸取“2.2.1”项对照品溶液0.20 mL，0.40 mL，0.60 mL，0.80 mL，1.00 mL，1.50 mL，置10 mL容量瓶中，以30%（体积分数）甲醇稀释至刻度，摇匀，制得系列浓度对照品溶液。 分别进样10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定HSYA的峰面积，以对照品质量浓度（ρ）为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，回归方程为：A=5.07409×105ρ-3.2829×104，r=0.9998，结果表明HSYA在1.22～9.15 μg/mL范围内与峰面积具有良好的线性关系。
2．5 精密度试验
分别精密吸取同一批HSYA对照品溶液10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样，平行测定6次，测得平均峰面积为3 087 600，RSD为2.16%。
2．6 稳定性试验
取同一供试品溶液(批号为070302)，每2 h进样1次，体积均为10 μL，按“2.1”项下色谱条件测定6次，测得样品中HSYA的平均质量浓度为0.0427 mg·mL-1，RSD%为0.87%。结果表明，供试品溶液在10 h内稳定。
2．7 重复性试验
取同一批号样品(批号为070302)，6份各约1 g，精密称定，按“2.2.2”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定。测得样品中HSYA的平均含量为1.0569 mg·g-1，RSD为1.29%。结果表明，样品重复性良好。
2．8 加样回收率试验
取6份已知含量的供试品1 g，精密称量，置于具塞锥形瓶中，分别加入浓度为0.059 mg/mL的HSYA对照品溶液10 mL，照“2.2.2”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，计算HSYA的回收率，结果平均回收率为100.93%，RSD为1.73%。
2．9 样品含量测定
取3批样品（批号20070302、20070312、20070322），按“2.2.2”项方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，在色谱条件进行测定，采用外标一点法计算样品中羟基红花黄色素A的含量。3批样品的测定结果分别为0.317 1、0.326 4、0.316 2 mg/片。
3 讨论
3．1 HSYA提取方法的优选［4］：曾分别采用水、30％（体积分数）乙醇、60％（体积分数）乙醇等为溶媒，以超声、回流和浸渍等方法对样品进行提取，以HSYA的提取率为指标，选择最佳提取方法。结果表明，样品以30％（体积分数）乙醇为溶剂超声30 min的提取液中HSYA的含量最高，确定以此作为样品的提取方法。
3.2 采用大孔树脂纯化脑得生片中的有效部位HSYA ［5］，并结合高效液相色谱法测定其含量，检测波长为403 nm时，阴性无干扰，专属性强。结果表明，该提取纯化方法切实可行，色谱条件简单，结果准确，重现性好，可有效控制该制剂的质量。
【】
［1］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：2005年版一部［S］. 北京：化学出版社，2005：572.
［2］ 李中原，涂秀华. 红花黄色素的药理研究进展［J］. 中药新药与临床药理，2006，16(2)：153-156.
［3］ 杨玉霞, 吴卫, 郑有良. 红花研究进展［J］. 四川农业大学学报，2004，22(4):365-368.
［4］ 周平兰，夏新华. 红花黄色素提取工艺的研究［J］. 湖南中医学院学报，2004，24(1)：11-12.
［5］ 宋洪涛，初 阳，张倩，等. 大孔吸附树脂纯化红花提取物的研究［J］. 中草药，2006，37(7)：996-1000.
