LC/MS/MS法测定兔血浆中的盐酸伪麻黄碱及美敏伪麻溶液的药动学研究

          作者：冯怡，黄羽，赖伟玲，巫志峰，欧润妹，邓远辉,曾星   

【摘要】  目的 建立兔灌胃美敏伪麻溶液后血浆中的盐酸伪麻黄碱的LC/MS/MS测定方法，并研究该制剂的药动学。方法 兔灌胃给药后采集各时点血样，经甲醇沉淀蛋白法处理，应用HPLC?ESI?三级四极杆串联质谱测定盐酸伪麻黄碱的浓度，采用统计矩分析方法药动学参数。结果 盐酸伪麻黄碱的线性范围为1～300 ng·mL-1 (r=0.995 5)，回收率为97.5%～108.5%，RSD均小于10%；药动学参数：t1/2为(1.8±0.4) h，Cmax为(26.6±9.6)μg·L-1，Tmax为(0.6±0.3) h，AUC0-t为(82.8±24.6) μg·h·L-1。结论 建立的方法灵敏、准确、快速、特异性强，适用于盐酸伪麻黄碱的血药浓度测定和药动学研究。

【关键词】  美敏伪麻溶液；盐酸伪麻黄碱；LC/MS/MS；血药浓度；药动学

Abstract:Objective To Establish an LC/MS/MS method for determining the concentration of pseudoephedrine in rabbit plasma．Methods Dextromethorphan?chlorpheniramine?pseudoephedrine solution was administered intragastrically to rabbits．The plasma sample was wiped off protein with methanol, and applied the HPLC?ESI?Triple quadruple tandem mass spectrometer to determine the concentrations of pseudoephedrine. Pharmacokinetics parameter was calculated by statistic moment analysis method. Results  The linear range was 1-300 ng·mL-1(r=0.9955) with the recovery 97.5%-108.5 %. The within?day and between?day deviations were less than 10%. The pharmacokinetic parameters of t1/2, Cmax, Tmax and AUC0-t were (1.8±0.4) h、(26.6±9.6) μg·L-1,(0.6±0.3) h and (82.8±24.6) μg ·h·L-1, respectively. Conclusion The method is sensitive，accurate，rapid and specific，which is suitable for the pharmacokinetic study of pseudoephedrine .

    Key words:dextromethorphan?chlorpheniramine?pseudoephedrine solution；pseudoephedrine；LC/MS/MS；pharmacokinetics

      美敏伪麻溶液在临床上用于缓解感冒及其过敏性症状, 盐酸伪麻黄碱是其主要成分之一。报道盐酸伪麻黄碱的血药浓度较低，采用碱化血浆?液液萃取?HPLC法测定［1，2］。但该法操作繁琐且萃取回收率较低，不能满足微量分析的要求。本文建立甲醇沉淀蛋白－液质联用法测定美敏伪麻溶液中的盐酸伪麻黄碱在兔体内的药动学过程，具有样品处理简单、灵敏度高等优点。现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1  仪器与试药

    　　美敏伪麻溶液(惠氏制药有限公司，批号：0704062)；盐酸伪麻黄碱对照品（药品生物制品检定所，批号1237-9601）；甲醇、乙腈（美国Fisher公司产品，色谱纯）；甲酸为分析纯；水为重蒸馏水。

    API3000型液相色谱?三级四极杆质谱联用仪（Agilent 1100液相色谱系统，美国AB公司）；IKA旋涡混匀器（广州I KA分析仪器公司）。

    1.2  LC/MS/MS条件 

    　　色谱柱为RESCEK Pinnacle Ⅱ C8柱（150 mm×2.1 mm，5 μm），流动相为甲醇?1%甲酸?乙腈（体积比50∶40∶10），流速为0.22 mL·min-1。ESI离子源，以多反应离子监测模式（MRM）进行正离子检测，定量离子对选择［M-CL+H］+：m/z：166.2→148.2，辅助气化气、雾化气、气帘气和碰撞气均为氮气，流量分别为：7、8、6、6 L·min-1，离子源喷雾电压：1 500 V，雾化温度：350 ℃。

    1.3  对照品溶液、标准曲线血浆样品和质控样品的配制

    　　精密称取盐酸伪麻黄碱对照品适量，用甲醇配制成1 mg·mL-1的对照品溶液，加入空白血浆配制浓度为1、3、10、30、100、250、300 ng·mL-1的标准曲线血浆和3、90、250 ng·mL-1质控血浆。

    1.4  血浆样品处理

    　　精密吸取血样100 μL，加入350 μL甲醇，涡旋混匀沉淀蛋白，以13 000 r·min-1离心10 min后取上清液60 μL，加入纯化水140 μL，涡旋混匀后用0.2 μm微型滤器离心过滤，得待测液，取20 μL进样分析。

   2  结 果

    2.1  方法专属性 

    　　经一级质谱扫描获得盐酸伪麻黄碱的准分子离子［M-CL+H］+：m/z 166.2，其二级质谱碎片离子为m/z 148.2和133.1等（图1），选择m/z 166.2→148.2离子对进行MRM定量分析。取空白血浆按“1.4”项下方法操作得色谱图2A；取最低质量浓度（1 ng·mL-1）血浆样品，同法处理得色谱图2B，保留时间为2.92 min；取家兔灌胃给药后采集的血浆样品，同法操作得色谱图2C。结果表明在1.5～2.5 min有一定的基质效应，但不影响目标物定量，也无内源性物质干扰，方法特异性强。

　　2.2  标准曲线及线性范围

    　　取标准曲线血浆样品按“1.4”项下操作，以盐酸伪麻黄碱色谱峰面积（A）为纵坐标，对质量浓度(ρ)进行回归分析（权重1/X2），得标准曲线

    A=8.94×103 ρ+2.39×104，r=0.995 5。确定本方法的定量范围为1～300 ng·mL-1。

    2.3  精密度与准确度

    　　取质控血浆样品按“1.4”项下操作，每个浓度的样品在1 d内作5份样品分析，连续测定3 d，方法的日内精密度RSD值和日间精密度RSD值。将实测值与真实值相比得相对回收率表示准确度。方法精密度与准确度数据见表1。

    2.4  稀释能力试验

    配制浓度为500 ng·mL-1的血浆样品5份，用空白血浆稀释5倍后按“1.4”项下操作，将测定值乘稀释因子后与标示值比较，准确度为(104.85±3.28)%，表明浓度高于定量范围上限的样品可用空白血浆稀释后测定。表1  血浆中盐酸伪麻黄碱的精密度与准确度
    2.5  稳定性试验 

    取3种浓度的质控血样分别在-20 ℃保存6个月、室温20 ℃放置12 h及经3个冷冻-融解循环处置，然后按“1.4”项操作，测定值与真实值比较相对偏差均<15%，数据见表2，结果表明血浆中盐酸伪麻黄碱是稳定的；血样制备后在室温20 ℃放置6 h，测定值与真实值比较相对偏差<10%，结果表明待测液稳定。表2  血浆中盐酸伪麻黄碱的稳定性

    2.6  药动学研究 

    取新西兰兔5只（广州中医药大学动物实验中心提供，合格证号：0028284），雄性，体质量2.4～2.5 kg，禁食12 h后灌胃美敏伪麻溶液10 mL(含盐酸伪麻黄碱60 mg)，于灌胃前、灌胃后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h取耳缘静脉血1 mL，置于肝素抗凝管中，离心(3 500 r·min-1)10 min，吸取上层血浆置-20 ℃冷冻保存。应用LC/MS/MS法测定盐酸伪麻黄碱的浓度，随行测定标准曲线和质控样本以保证结果的可靠性。绘制平均血药浓度?时间曲线（图3），以药代动力学软件?DAS2.0程序进行拟合，采用统计矩分析方法计算所得的药动学参数见表3。 表3  兔灌胃给药盐酸伪麻黄碱60 mg后的药动学参数

　　3  讨 论

    　　简化制备过程是生物样品定量分析的现实需求和方向，但对分析仪器的性能要求也更高，本文采用的液?质联用系统的离子源具有气帘气反吹的抗污染设计，其喷针与进样孔成夹角的非线性进样技术，可有效减少杂质的污染。

    　　应用液?质联用技术测定生物样品多数采用内标法［3，4］，且最好选用同位素取代的内标物，但这些内标物价格昂贵而难得［5］，筛选其他合适内标物也需要一定的摸索过程。本文样品制备方法简单、仪器系统稳定性佳（10 h内系统适应性样品峰面积的RSD<2%，n=20），故使用外标法定量。选择响应较高的m/z 166.2→148.2离子对进行MRM测定，其色谱峰也避开了生物基质的影响，灵敏度达到了1 ng·mL-1。本法操作简单、特异性强、灵敏度高，血样仅需100 μL，单样品分析仅需4.0 min，各项方法学指标符合生物样品定量分析的要求，可满足药动学研究大量样品的快速测定。 美敏伪麻溶液在兔体内的初步药动学研究结果表明，其主要成分盐酸伪麻黄碱的达峰时间较短，表明起效较快，而血药浓度较低。

【】
  ［1］ 魏敏吉，张朴，王珊，等.高效液相色谱测定人体血清中低浓度盐酸伪麻黄碱的含量［J］.药物分析杂志，2005,25：512-515.

［2］ 林观样，王志强，张春红，等.高效液相色谱法测定人血中伪麻黄碱的含量［J］.药学杂志，2005,25：824-826.

［3］ 苏明明，聂玉晓，贾伟，等.反相高效液相色谱／电喷雾质谱法测定血浆中盐酸舍曲林［J］.分析化学，2006,34：1145-1148.

［4］ 戴晓健，陈笑艳，张勇，等.液相色谱一串联质谱法同时测定人血浆中金刚烷胺和氯苯那敏［J］.药物分析杂志，2006,26：713-717.

［5］ 陈焕文，李明，周建光，等.电喷雾解吸电离质谱法用于临床尿样的直接分析［J］.高等学校化学学报，2006,27：1439-1442.