HPLC法测定注射用甲硫氨酸维B1中甲硫氨酸和维生素B1的含量

【摘要】  目的 建立测定注射用甲硫氨酸维B1中甲硫氨酸和维生素B1的含量的方法。方法 釆用高效液相色谱法，色谱柱：ODS?C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相：缓冲液［取庚烷磺酸钠0.25 g，用磷酸钠溶液（取磷酸钠38 g,加水至1 000 mL使溶解，用磷酸调pH值至2.1）溶解并稀释成1 000 mL］?乙腈（体积比94∶6），流速1.0 mL/min，检测波长为21 0nm。结果 甲硫氨酸在0.60～1.40 mg/mL浓度范围内线性关系良好( r=0.999 6)，维生素B1在0.06~0.14 mg/mL浓度范围内线性关系良好 (r=0.999 8)；平均回收率分别为：甲硫氨酸100.49%　(RSD为0.62%),维生素B1 99.95% (RSD为 0.48%）。结论 本法简便、快速、灵敏、准确，重现性好，可作为注射用甲硫氨酸维B1中甲硫氨酸和维生素B1的含量测定方法。

【关键词】  高效液相色谱法；注射用甲硫氨酸维生素B1；甲硫氨酸；维生素B1

　　注射用甲硫氨酸维B1为甲硫氨酸和维生素B1的复合制剂。本品对于急慢性肝炎、肝硬化，尤其是对脂肪肝有特别的疗效；可用于肝内胆汁郁积以及乙醇、巴比妥类、磺胺类药物中毒时的辅助；并可作为治疗神经炎和心肌炎的辅助药物。目前对其注射剂及冻干粉针剂的含量测定已有报道［1-3］。为有效控制产品质量，本文直接采用HPLC法测定其主要成分甲硫氨酸和维生素B1的含量，方法简便，结果准确。

　　1  仪器与试药  

　　日本岛津高效液相色谱仪(SPD?10Avp检测器,LC?10Atvp泵)，工作站：AnaStar色谱处理系统，色谱柱：Kromasil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。  

　　甲硫氨酸对照品（批号为140684?200401）、维生素B1对照品（批号为100390?200502）由药品生物制品检定所提供；注射用甲硫氨酸维B1（本公司自制，批号为050318、050319、050320，规格：甲硫氨酸40 mg与维生素B1 4 mg）；乙腈为色谱纯，庚烷磺酸钠、磷酸钠、磷酸为分析纯。

　　2  方法与结果

　　2.1  色谱条件  色谱柱: ODS?C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)；流速: 1.0 mL/min；检测波长：210 nm；流动相：以缓冲液［取庚烷磺酸钠0.25 g，用磷酸钠溶液（取磷酸钠38 g,加水至1 000 mL使溶解，用磷酸调pH值至2.1）溶解并稀释成1 000 mL］?乙腈（体积比94∶6）；进样量：20 μL；测定方法：外标法，积分峰面积。

　　2.2  对照品溶液的制备  精密称定甲硫氨酸对照品50 mg和维生素B1对照品5 mg，置同一50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.3  供试品溶液的制备  取本品细粉适量(约相当于甲硫氨酸50 mg)，精密称定，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

　　2.4  干扰试验  分别精密量取对照品溶液、供试品溶液、空白溶剂20 μL，注入液相色谱仪，结果空白溶剂无干扰峰，见图1。

　　2.5  线性关系  精密称定甲硫氨酸对照品约100 mg和维生素B1对照品约10 mg，置同一10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，分别取上述溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，分别置10 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，以对照品溶液质量浓度(ρ)为横坐标，测得峰面积值(A)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：甲硫氨酸A=5.597×106ρ+2.493×105,r=0.999 6;维生素B1 A=1.163×107ρ+2.147×104,r=0.999 8。　　

　　结果表明甲硫氨酸在0.60～1.40 mg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好线性关系；维生素B1在0?06~0.14 mg/mL质量浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。

　　2.6  精密度试验和稳定性试验       取同一份对照品溶液，分别重复进样6次，每次进样20 μL，结果甲硫氨酸和维生素B1 RSD分别为0.89%和1.13%。   

　　A.对照品; B.样品; C. 空白溶剂     　1、维生素B1   2、甲硫氨酸

　
　　图1  HPLC色谱图（略）
　
　　Fig.1  HPLC chromatograms   

　　取同一份对照品溶液，在室温条件下放置6 h，分别在0、2、4、6 h测定1次，结果甲硫氨酸和维生素B1的RSD分别为0.89%和0.94%,表明本品溶液在6 h内稳定。

　　2.7  重复性试验       精密称取同一批样品6份(批号050318)，按“2.3”项下方法处理后，分别进样20 μL，测定含量。结果：甲硫氨酸和维生素B1的平均含量分别为100.08%和100.92%,RSD分别为1?32%和1.46%。  

　　2.8  回收率试验       分别取甲硫氨酸对照品和维生素B1对照品适量（约相当于甲硫氨酸80 mg、100 mg、120 mg，维生素B18 mg、10 mg、12 mg）各3份，精密称定，按“2.2”项下方法操作，测定，并回收率，结果甲硫氨酸和维生素B1平均回收率分别为100.49%和99.95%，RSD值分别为 0.62%和0?48%。见表1和表2。

　　表1  甲硫氨酸回收率试验结果（略）

　　Tab.1  Results test of methionine

　　平均回收率=100.49%,　 RSD=0.62%

　　2.9  样品测定       分别精密量取3个批号的供试品溶液及对照品溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算供试品中甲硫氨酸（C5H11NO2S）和维生素B1（C12H17CIN4OS·HCl）的含量。测得3批样品的质量分数分别为：甲硫氨酸100.19%，100.38%和100.31%；维生素B1　101?10%，101.17%和101.19%。

　　表2  维生素B1回收率试验结果（略）

　　Tab.2  Results test of vitamin B1

　　平均回收率=99.95%,　 RSD=0.48%

　　3  讨论

　　3.1  回收率试验供试品溶液的制备  由于本制剂中未添加辅料，因此在进行回收率试验时，直接分别称取甲硫氨酸和维生素B1对照品，按照“2.2”项下方法操作即可。

　　3.2  流动相的选择  在选择检测波长210 nm的情况下，曾比较乙腈?25 mmol/L磷酸盐缓冲液(体积比60∶40，pH3.5）作为流动相［3］，测定结果无明显差异。考虑到乙腈毒性大，而文中所用流动相乙腈?缓冲液（体积比6∶94），乙腈含量明显低于对比流动相，因此选择文中所用流动相较好。

【】
  　　［1］ 黄榕珍.高效液相色谱法测定甲硫氨酸维生素B1注射液中甲硫氨酸和维生素B1的含量［J］.海峡药学,2005,17(5)：42-45 .

　　［2］ 纪宇，刁勇，王晨霞. 高效液相色谱法测定甲硫氨酸维B1注射液的含量 ［J］.生化药物杂志，2005，26(4)：228-229 .

　　［3］ 徐晖，卢懿. HPLC法测定注射用甲硫氨酸维生素B1中甲硫氨酸的含量［J］.华西药学杂志,2006,21(2)：210-211 .