HPLC?ELSD法测定注射用硫酸异帕米星含量

【摘要】  目的 建立高效液相色谱?蒸发光散射检测(HPLC?ELSD)法测定注射用硫酸异帕米星含量的方法。方法 色谱柱为Zorbax SB?C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为1%三氟醋酸水溶液?甲醇(体积比95∶5)),流速:0.5 mL/min; 蒸发光散射检测器,漂移管温度45 ℃,载气压力368 Pa。结果 异帕米星在0.1~0.8 mg/mL的范围内呈较好的线性关系(r=0.9995),平均回收率101.0%,RSD=0.32%;系统精密度RSD=0.34%。结论 本方法操作简便、快速，方法的精密度、准确性、重现性均较好地满足质量控制的要求，可用于注射用硫酸异帕米星的质量控制。

【关键词】  高效液相色谱法; 蒸发光散射检测器; 硫酸异帕米星

　　Abstract:Objective To establish an HPLC?ELSD method for the quantification of isepamicin sulfate in the injection. Methods The analysis was performed on a column of Zorbax SB C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm ). The mobile phase consisted of 1% tifluoroacetic?methanol (95∶5)and the flow rate was 0. 5 mL·min-1. The drift tube temperature was 45 ℃， ELSD was used as the detector with pressure of nebulizing gas of 368 Pa. Results The calibration curve was linear in the range of 0.1~0.7 mg/mL (r=0. 9995). The average recovery was 101. 0% with RSD 0.32%. Conclusion This method is simple, rapid, accurate and reproducible for the quality control of the injection of isepamicin sulfate.

　　Key words:HPLC; evaporative light-scattering detection; isepamicin sulfate

　　硫酸异帕米星为氨基糖甙类抗生素,由庆大霉素B半合成而来，目前仅在日本抗生素基准解说（简称“日抗基”）中收载。“日抗基”中采用抗生素微生物检定法测定硫酸异帕米星的含量,操作烦琐、测定误差较大。由于氨基糖甙类抗生素无紫外吸收,无法采用紫外检测器，因此,通常采用衍生化的方法进行测定［1~2］，但该法操作烦琐、费时,而且反应过程中可能会产生副产物,干扰有关物质的测定。蒸发光散射检测器（ELSD）是一种通用型质量检测器,其响应不依赖物质的光学特征,对无紫外或紫外末端吸收的有机化合物的检测显示出极大的优越性。有报道用蒸发光散射检测器进行氨基糖甙类抗生素的质量分析［3］。本研究建立了在酸性条件下HPLC?ELSD法测定注射用硫酸异帕米星含量的方法,测定结果与“日抗基”中收载的微生物检定法的测定结果基本一致。

　　1  材料与方法

　　1.1  仪器与试剂岛津高效液相色谱系统2010CHT型和SEDEX 75型蒸发光散射检测器;Zorbax SB?C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)。三氟醋酸为TEDIA COMPANY INC产品,分析纯;水为自制双蒸水。硫酸异帕米星标准品（规格：684 mg/g,批号：050701）及注射用硫酸异帕米星由海南长安国际制药有限公司提供。

　　1.2  色谱条件采用1%三氟醋酸水溶液?甲醇(体积比95∶5)为流动相,流速为0.5 mL/min;ELSD检测器漂移管温度为45 ℃, 载气压力368 Pa;进样量20 μL。

　　1.3  溶液的配制

　　1.3.1  标准品溶液的配制  取硫酸异帕米星标准品,精密称定,用水溶解,分别制成浓度为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的标准溶液,每个浓度平行配制2份。

　　1.3.2  供试品溶液的配制  取供试品注射用硫酸异帕米星,精密称定,用水溶解,制成浓度为0.5 mg/mL的溶液,平行配制6份。

　　1.4  方法学考察

　　1.4.1  线性关系 精密称取异帕米星对照品适量,加水制成含注射用硫酸异帕米星0.1、0.2、0.4、0.6及0.8 mg/mL的溶液, 分别进样20 μL, 以浓度的常用对数（X）为横坐标,以峰面积的常用对数（Y）为纵坐标作图,得回归方程：Y=1.249 6X+5.663，r=0?999 5。结果表明异帕米星在0.1~0.8 mg/mL的范围内呈较好的线性关系。

　　1.4.2  精密度试验  取对照品溶液,连续进样6针,以主峰峰面积计算RSD为0.34%。

　　1．4．3  稳定性试验  取供试品（批号051101）溶液,分别于0、1、2、4、6、8  h取20 μL,注入液相色谱仪,记录色谱图,结果RSD为0.78%。

　　1．4．4  重复性试验  取同一批供试品（批号051101），配制成6份溶液，分别进样分析，含量测定结果的RSD为0.6%(n=6)。

　　1.5  回收率试验精密称取已知含量的注射用硫酸异帕米星适量（高、中、低各3份）和与之相对应量（按注射用硫酸异帕米星处方比例）的硫酸异帕米星标准品9份，分别置于100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，取20 μL注入液相色谱仪进行测定,回收率，测得回收率分别为100.8%、100.9%和101.4%，平均回收率为101.0%，RSD为0.32%,表明回收率良好。

　　2  含量测定结果

　　采用本法测定3批注射用硫酸异帕米星的含量；按申报的质量标准测定方法，采用微生物检定二剂量法测定注射用硫酸异帕米星的含量，结果见表1。结果表明两种方法的含量测定结果非常接近。硫酸异帕米星供试品溶液的色图谱见图1。

　　3  讨论

　　3.1  本文所建立的HPLC?ELSD方法与目前药典采用的效价方法及英、美等国家采用的衍生化方法比较，具有以下优点:不需要进行衍生化，减少了样品前处理所带来的误差，提高了分析的精度。

　　表1  3批样品HPLC?ELSD法与微生物检定法测定结果（略）

　　Tab.1  Content of isepamicin sulfate detected by HPLC?ELSD and antibiotics?microbial assays, separately

　　1.硫酸根; 2.异帕米星

　　图1  硫酸异帕米星测定HPLC色谱图（略）

　　Fig.1  HPLC chromatigram of isepamicin sulfate

　　3.2  已有报道采用0.05 mol/L五氟丙酸溶液?甲醇系统为流动相测定硫酸异帕米星原料的含量［3~4］，未见对注射用异帕米星的含量进行测定的文献报道，本文参照硫酸小诺霉素注射液的小诺霉素组分测定方法［5］建立了测定注射用异帕米星含量的HPLC?ELSD法，结果表明本法可靠、可行。

【文献】
  　　［1］ JILL A M. High?performance liquid chromatographic determi?nation of isepamicin in plasma, urine and dialysate ［J］.J Chromatogr,1990,526:487-488.

　　［2］ MAYUMI S, KOICHIRO K, EIKO Y,et al. Column liquid chro?matographic determination of isepamicin in navity using gauze［J］.J Chromatogr,1990,529:473-475.

　　［3］ 王明娟,成双红,张斗胜，等.HPLC?ELSD法测定异帕米星含量［J］.中国抗生素杂志，2003，28（1）：20-21.

　　［4］ 王建,洪利娅,倪坤仪,等.高效液相色谱?蒸发光散射检测法测定硫酸异帕米星及其有关物质的含量［J］.分析化学,2006（1）:19-22.

　　［5］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:二部［M］.北京：化学出版社，2005:719.