RP?HPLC法测定镇咳灵合剂中橙皮苷的含量

                       作者：龙荣，祝文兵，彭芳玲，胡勤

【摘要】  目的：建立RP?HPLC法测定镇咳灵合剂中橙皮苷的含量。方法：采用Hypersil ODS2（4.6 mm×200 mm，5 μm）色谱柱，流动相∶乙腈?水（19∶81），流速1.0 mL/min，检测波长283 nm。结果：橙皮苷在进样量为0.6328～5.0624 μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=190.570X?2.789（r=0.999 9，n=6），平均加样回收率为101.10%，RSD为1.54%。结论:本方法测定简便，结果准确，重现性好，可作为制剂的质量控制。

【关键词】  镇咳灵合剂；橙皮苷；反相高效液相色谱法；含量测定

    ［Abstract］ Objective: To establish a RP?HPLC method for determination of the content of hesperidin in Zhenkeling mixture. Methods: The separation was performed on a Hypersil ODS2 (4.6 mm×200 mm, 5 μm) column. The mobile phase was acetonitrile?water (19∶81), the flow rate was 1.0 mL/min, the detecting wavelength was at 283 nm. Results: The hesperidin had a good linear relation between 0.6328～5.0624 μg/mL (r=0.9999, n=6), the average recovery was 101.10%, RSD was 1.54%. Conclusions: This method was simple, accurate and repeatable. It can be used for quality control in production of Zhenkeling mixture.

    ［Key words］  Zhenkeling mixture; Hesperidin; RP?HPLC; Assay

    镇咳灵合剂为我院自制制剂，由板兰根、陈皮、川贝、荆芥、金银花、桔梗、杏仁、地龙、浙贝母等中药组成，具有清热宣肺、止咳祛痰的功效，主治咽喉红肿、痰白稠黄、大便干结之热咳。原质量标准仅有常规检查及鉴别检查，无含量测定。橙皮苷为陈皮中所含有效成分，已有报道制剂中橙皮苷的含量测定方法［1?3］，但对镇咳灵合剂中橙皮苷的含量测定未见报道。本文采用反相高效液相色谱法对镇咳灵合剂中橙皮苷进行含量测定，以控制其内在质量，方法学考察结果令人满意。

    1  仪器与试药

    Agilent 1100 高效液相色谱仪，Agilent 1100 VWD检测器，Chemstations工作站（Agilent公司，美国）；梅特勒?托利多AB135?S分析天平（瑞士）；TG16?W微量高速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；WH?2 微量旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）

    橙皮苷对照品，药品生物制品检定所提供，批号110721?200613；镇咳灵合剂，自制，规格100 mL，每毫升含陈皮药材70 mg，批号：070320、070410、070428、070605、070710；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水。

    2  方法与结果

    2.1  色谱条件

    色谱柱：Hypersil ODS2（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相：乙腈?水（19∶81），流速：1.0 mL/min；检测波长：283 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。理论塔板数按橙皮苷峰不低于2 000。此条件下主峰与杂质峰达到基线分离（R>1.5）。

    2.2  对照品储备液的配制

    精密称取橙皮苷对照品7.91 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度为0.3164 mg/mL的橙皮苷对照品溶液，取上述溶液用甲醇稀释成质量浓度为63.28 μg/mL的对照品储备液，备用。

    2.3  样品溶液的制备

    精密量取1 mL镇咳灵合剂，置于25 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min放置至室温，加甲醇稀释至刻度、摇匀、离心（15 000 r/min）10 min，取上清液用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

    2.4  空白样品及空白样品溶液的制备

    除陈皮外，按照处方比例精密称取所需各药材，按镇咳灵合剂的制备工艺制成相应的空白样品。取空白样品1 mL，按样品溶液的制备方法制成空白样品溶液。

    2.5  空白干扰试验

    按照上述色谱条件，吸取空白样品溶液、对照品溶液、样品溶液，分别注入色谱仪，结果见图1。空白样品溶液中的组分不干扰样品溶液中橙皮苷的测定。橙皮苷的保留时间为12.1 min。

    A?空白样品                       B?对照品                           C?样品

    图1   橙皮苷HPLC色谱图（1?橙皮苷）

    2.6  线性试验

    分别精密吸取63.28 μg/mL的对照品储备液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，分别精密吸取上述溶液10 μL，进样，测定峰面积，以色谱峰面积（Y）为纵坐标，对照品溶液浓度（X）为横坐标，外标法得橙皮苷标准溶液的线性回归方程为：Y=190.570X?2.789（r=0.9999，n=6）。结果表明：橙皮苷浓度在0.6328～5.0624 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

    2.7  精密度试验

    精密吸取63.28 μg/mL的对照品储备液0.3 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得浓度为1.8984 μg/mL橙皮苷对照品溶液，取上述溶液10 μL，重复进样5次，以峰面积精密度，结果橙皮苷峰面积RSD为1.0%。

    2.8  加样回收率试验

    精密量取已知含量的样品1 mL，加入63.28 μg/mL橙皮苷对照品储备液1 mL，橙皮苷加入量为63.28 μg，按“2.3”项下方法操作，进样测定并计算回收率，结果见表1。表1   橙皮苷加样回收率试验

    2.9  稳定性试验

    取同一样品，按“2.3”项下方法操作，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定橙皮苷含量，结果样品溶液在24 h内稳定性良好，橙皮苷含量RSD为1.2%。

    2.10  样品测定

    取5批不同批号的镇咳灵合剂，按上述样品溶液的制备方法制备成样品溶液，分别精密吸取10 μL，按上述色谱条件测定并用外标法计算橙皮苷含量，结果5批样品的含量分别为：60.55 μg/mL（批号：070320）、61.03 μg/mL（批号：070410）、59.92 μg/mL（批号：070428）、61.17 μg/mL（批号：070605）、59.78 μg/mL（批号：070710）。

    3  讨论

    本文在橙皮苷的含量测定方法［4?8］的基础上对色谱条件进行适当的调整测定镇咳灵合剂中的橙皮苷含量。在本实验条件下，待测物的分离效果好，保留时间约12.1 min，空白样品中的杂质峰不影响待测物的出峰。用本方法测定镇咳灵合剂中橙皮苷的含量，方法简便，结果准确，重现性好，可作为制剂的质量控制。

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