E-test监护病房革兰阴性杆菌耐药性的7年动态研究

                  作者：王华丽 盛家琦 黄文祥 余登高 郑行萍

【摘要】  目的 调查我院重症监护病房中革兰阴性杆菌耐药状况，了解超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)菌株的产生率，并比较近年来我院细菌耐药性的变迁，为临床合理用药提供。方法 用E-test法测定我院重症监护病房住院患者感染灶分离的108株革兰阴性杆菌对12种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC)及细菌产ESBLs的情况。结果 亚胺培南对所有受试菌抗菌活性最高，耐药率为16.7%；头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、头孢吡肟、哌拉西林/三唑巴坦及替卡西林/克拉维酸、头孢他啶和ertapenem的耐药率为34.2%～49%；其它4种抗菌药物耐药率均在60%～69.4%之间。筛选出大肠埃希菌、克雷伯菌属的ESBLs产生菌24株，ESBLs检出率分别为44.4%和53%；亚胺培南对所有大肠埃希菌和克雷伯菌属产ESBL株均较敏感。新型青霉烯类抗菌药物ertapenem(MK-0826)对收集的108株革兰阴性杆菌的抗菌活性较前下降，总耐药率为41.7%。七年资料相比，头孢哌酮/舒巴坦耐药率由16.7%增至37%，头孢他啶的耐药率亦明显增高，由1998年的26.2%增高到2005年的49%，除哌拉西林/三唑巴坦、替卡西林/克拉维酸的耐药率变化不大外，其他抗菌药物的耐药率变化较大。结论 亚胺培南对所分离的细菌均表现较高的敏感性，对ESBLs产生菌亦有较强的抗菌活性。7年来细菌对所检测药物的耐药率均有不同程度增加。

【关键词】  革兰阴性杆菌； 耐药性； E-test； ESBL

    ABSTRACT  Objective  To investigate the resistant rates of Gram-negative bacilli in ICU and ESBLs-producting strains.  Method  Using E-test to detect the minimal inhibition concentration (MIC) of 12 antibiotics against 108 strains of Gram-negative bacilli.  Results  The drug-resistance rate of imipenem is the lowest one, 16.7%; cefoperzone/sulbactam, amikacin, cefepime, piperacillin/tazobactam, ticarcillin/clavulanic acid ceftazidime and ertapenem  have slightly higher drug-resistance rates of around 34.2%～49%, for others 60%～69.4%. Twenty-four strains of ESBLs-producing bacilli have been selected from Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae, the positive rates are 44.4% and 53% respectively. Imipenem is susceptible to all Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Compared to the survey in the last six years, the drug-resistant rate of cefoperzone/sulbactam is increased from 16.7% to 37%, ceftazidime increased from 26.2% in 1998 to 49% in 2005, other drugs have changed significantly except piperacillin/tazobactam and ticarcillin/clavulanic. Conclusion  Imipenem remains the highest antibacterial activity against all the detected strains and is still effective to ESBLs-producing strains; in the last 7 years, due to the abuse of antibiotics with β-lactamase inhibitors leads to drug-resistant rate increase significantly.

    KEY WORDS  Gram-negative bacilli;  Drug- resistance;  E-test;  ESBL

    近半个世纪以来，革兰阴性杆菌已成为感染的重要致病菌，这类感染的抗菌药物主要是第三代头孢菌素和单环类抗菌药物。随着这两类药物的广泛应用，细菌耐药率逐年增加且出现多重耐药的特点。哈佛大学医学院连续9年的监测研究显示［1］，1994年～2002年间，多重耐药的大肠埃希菌从0.2%增至4.0%，肠杆菌属细菌从4.0%增至13.0%，铜绿假单胞菌从1.0%增至16.0%，且多重耐药的模式扩大，从第三代头孢菌素到氨基糖苷类及喹诺酮类抗菌药物。国内医院感染革兰阴性杆菌的耐药情况更严峻，据国家细菌监测中心报道［2］，1999年～2002年北京、广州、湖北和辽宁等地区临床分离的大肠埃希菌、克雷伯菌属对头孢噻肟/克拉维酸、头孢他啶的耐药率明显增加。4年间上述地区临床分离的大肠埃希菌对头孢噻肟/克拉维酸的耐药率分别由19.0%、26.7%、11.0%和10.9%上升至24.0%、37.2%、24.3%及24.1%。

    为掌握我院医院监护病房中革兰阴性杆菌对12种抗菌药物的耐药特征，了解耐药细菌的分布，自2005年起连续一年对全院7个重症监护病房的各种感染患者进行耐药监测，共分离出革兰阴性杆菌108株。用E-test法将致病菌对12种抗菌药物作体外药敏试验，并检测分离菌中的ESBLs产生率，同时对我院近6年监测结果进行比较。现将结果报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    (1)标本来源  痰62份(来自气管插管19份)，尿液23份(导尿管13份)，皮肤软组织、中耳及伤口创面脓液9份，胸、腹、盆腔引流物7份，血4份，咽拭子2份，胆汁1份，排除同一患者不同部位的相同菌株。所有菌株均由APl20(Bio-Merieux)鉴定系统进行确认。质控菌为大肠埃希菌ATCC25922和铜绿假单胞菌ATCC27853。大肠埃希菌ATCC35218和肺炎克雷伯菌ATCC700603为ESBLs质控株。

    (2)菌株种类  108株革兰阴性杆菌包括大肠埃希菌36株，铜绿假单胞菌25株，鲍曼不动杆菌20株，克雷伯菌属15株(肺炎克雷伯菌13株，产酸克雷伯菌2株)，肠杆菌属8株(阴沟肠杆菌6株，产气肠杆菌2株)，嗜麦芽寡养单胞菌3株，奇异变形菌1株。

    (3)E-test试条  E-test试条为瑞典AB Biodisk公司产品。

    抗菌药物有哌拉西林/三唑巴坦(PIPC/TB)、替卡西林/克拉维酸(TIPC/CA)、头孢哌酮/舒巴坦(CPZ/SB)、头孢噻肟(CTX)、头孢曲松(CRO)、头孢他啶(CAZ)、头孢吡肟(CFP)、亚胺培南(IMP)、ertapenem(ETM)、庆大霉素(GM)、阿米卡星(AMK)和环丙沙星(CPLX)。E-test浓度范围为0.008～256μg/m1。ESBLs确证试条为头孢他啶/头孢他啶+克拉维酸，其抗菌浓度范围为0.5～32和0.064～4μg/ml，头孢噻肟/头孢噻肟+克拉维酸，浓度范围为0.25～16和0.016～1μg/ml。

    1.2  方法

    (1)菌液制备  细菌接种在肉汤中37℃孵箱中过夜，用1.5×108CFU/ml浓度在超净台上用无菌棉签涂平板。

    (2)E-test方法  平皿比较干燥后，每个平皿放6条药物试条，每个试条间成60度角，试条放下后不能移动也不能有气泡。置35℃孵箱18～24h，读取MIC值，质控菌MIC值应落于美国临床实验室标准研究所(CLSI)2005年［3］规定范围。

    (3)筛选、确证产ESBL菌株  按照CLSI 2005年推荐标准，凡头孢他啶或头孢噻肟MIC≥2μg/m1的菌株(特别是大肠埃希菌和克雷伯菌属)均应检测产ESBLs情况。按上述方法，对头孢他啶或头孢噻肟MIC≥2μg/m1的菌株进行测定，以CAZ/CAZ-CA大于或等于8或CTX/CTX-CA比值大于或等于8，判定为ESBLs阳性。以ESBLs阳性株数在监测细菌中的比例ESBLs检出率。

    (4)抗菌药物临界敏感浓度(mg/L)  依据CLSI 2005年标准，哌拉西林/三唑巴坦≤16(非发酵菌≤64)，替卡西林/克拉维酸≤16(非发酵菌≤64)，头孢哌酮/舒巴坦≤16，头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟≤8，亚胺培南、ertapenem、庆大霉素≤4，阿米卡星≤16，环丙沙星≤1。

    (5)统计学处理  数据采用WHONET5.3软件分析结果。

    2  结果

    2.1  E-test法测定结果

    108株革兰阴性菌的E-test测定结果列Tab.1。从Tab.1可见，监护病房分离的致病菌主要是大肠埃希菌(33.3%，36/108)、铜绿假单胞菌(23.1%，25/108)、鲍曼不动杆菌(18.5%，20/108)和克雷伯菌属(13.8%，15/108)，与前六年结果相似［4～7］。

    2.2  ESBLs的检出率和耐药率

    108株革兰阴性菌ESBLs检出率见Tab.2。Tab.2显示，36株大肠埃希菌中ESBLs(+)株16株，检出率为44.4%；克雷伯菌属15株，检出ESBLs(+)株8株，检出率为53%。我院前6年在大肠埃希菌和克雷伯菌属中ESBLs的检出率分别为49.4%和33.3%，与解放军总医院ICU的分离率(52．4%和43．5%)相似［8］。大肠埃希菌和克雷伯菌属的ESBLs产生菌仍对亚胺培南保持高度敏感。

    产ESBL株和非产ESBL株的耐药率有显著差别，产酶株耐药率明显高于非产酶株(Tab.3)，细菌对12种抗菌药物的耐药率见Tab.4。

    从Tab.4可以看出大肠埃希菌对头孢曲松、庆大霉素和环丙沙星耐药率分别高达50.0%、61.1%和69.4%，对头孢噻肟的耐药率亦达44.4%：对ertapenem、哌拉西林/三唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦和头孢他啶则高度敏感，耐药率在11.1%～19.4%之间，对头孢吡肟、替卡西林/克拉维酸和阿米卡星亦较敏感，耐药率在22.2%～27.8%之间；对亚胺培南仍保持最高敏感度，耐药率仅5.6%。

    从Tab.5可见7年间动态监测结果显示，重症监护病房中4种主要的革兰阴性杆菌对所检测的11种抗菌药物的耐药率有普遍增高，其中第三代头孢菌素中的头孢噻肟、头孢他啶、头孢曲松，第四代头孢菌素头孢吡肟，庆大霉素，阿米卡星，环丙沙星以及加酶抑制剂头孢哌酮/舒巴坦增幅较大。* 部分数据资料引自导师盛家琦教授以及我科卓超、曾爱忠等作者。

    从Tab.6可以看出，七年间细菌耐药率在不断变迁，总的趋势是耐药率逐渐增高，但亚胺培南仍保持相对稳定的抗菌活性，包括对ESBL产生菌。

    3  讨论

    监护病房的患者常合并各种严重的基础疾病，并多暴露于气管插管、留置导尿管、深静脉插管、吸氧管及鼻饲管等院内感染的高危因素中，部分有意识障碍、昏迷或瘫痪的患者因长期卧床而导致吸入性肺炎及褥疮感染。这些患者由于反复感染而轮番使用多种抗菌药物，使得从其感染灶所分离的致病菌对多种抗菌药物耐药而导致治疗失败。

    为更好掌握监护病房细菌的耐药谱，我们采用E-test法进行了7年的动态监测。E-test药敏试验法结合了稀释法和扩散法的原理和特点，既具有扩散法简便的特点，亦与稀释法一样可以直接测定抗菌药物的MIC值，结果准确，重复性好。即使对于一些不能用纸片扩散法进行药敏试验的菌株(如铜绿假单胞菌和不动杆菌以外的其他非发酵菌)本法仍适用［9，10］。

    细菌监测结果显示，监护病房患者感染灶的致病菌主要分离自呼吸系统和泌尿系统。大肠埃希菌(33.3%)和铜绿假单胞菌(23.1%)仍是监护病房的主要致病菌，其次是鲍曼不动杆菌属(18.5%)和克雷伯菌属(13.8%)。说明在我院存在一定的流行趋势。

    药敏监测结果显示，7年来监护病房革兰阴性杆菌对11种抗菌药物的耐药率均有不同程度的增高。增幅最大，超过60%的4个品种为头孢噻肟(从1998年的34.5%增至2005年的60%)、头孢曲松(43.9%增至62.9%)、庆大霉素(47.6%增至69.4%)和环丙沙星(57.1%增至62.9%)，这与我院大量使用第三代头孢菌素而造成的选择压力相关。庆大霉素虽用量不大，却是全院局部用药最多的品种，多数科室用于留置导尿管患者的膀胱冲洗液、气雾吸入剂以及伤口换药等；其次为头孢他啶(26.2%增至49%)、头孢吡肟(从2000年的21.4%增至45.3%)、阿米卡星(16.7%增至43.5%)和替卡西林/克拉维酸(46.4%至43.5%)，其中替卡西林/克拉维酸变化不大，且有下降的趋势，头孢哌酮/舒巴坦(16.7%增至37%)和哌拉西林/三唑巴坦(20.2%增至34.2%)增幅不如第三代和第四代头孢菌素，表明耐药株对第三、四代头孢菌素仍有部分优势；亚胺培南的耐药率(7.14%增至16.7%)7年来已有一倍多的增长，但仍不失为对付革兰阴性杆菌，包括产ESBL菌(24株产ESBL菌仅有2株耐药)最强的抗菌药物，总敏感率达83.3%。

    大肠埃希菌对环丙沙星和庆大霉素7年来显示较高耐药率，本次监测已达69.4%和61.1%，对产ESBL株达到93.8%和62.5%；对头孢噻肟和头孢曲松7年耐药率增长近3倍，分别为44.4%和50%，对其产ESBL株的耐药率分别为75%和87.5%，但对头孢他啶包括产ESBL株保持较高的敏感度(81.2%)，表明我院分离的产ESBL株主要产生的是头孢噻肟酶(ceftaximase，CTX-M)［11］，其特点为对头孢噻肟的水解率远高于头孢他啶。由于携带ESBL基因的质粒常可携带对氨基糖苷类、喹诺酮类等抗菌药物耐药的基因，故这类产酶株常使环丙沙星和庆大霉素呈现较高的耐药率。这是由于细菌转座子能将几个耐药基因在单个质粒上集聚，这也是细菌发生多重耐药的重要原因。大肠埃希菌除对亚胺培南继续保持最高的敏感度(94.4%)外，对三种酶抑制剂复合物、头孢吡肟、ertapenem及阿米卡星的耐药率都在30%以下，具有较好的优势，但阿米卡星7年来耐药率已增长3倍多。

    克雷伯菌属(包括产ESBL菌株)过去6年对亚胺培南全部敏感， 本次则有1株产ESBL株耐药； ertapenem与亚胺培南一样敏感(两者敏感率均为93.3%)；对头孢吡肟和哌拉西林/三唑巴坦的耐药率均为26.7%，7年来仍保持较好的抗菌活性；其余8个品种耐药率在33.3%～60%之间，尤其头孢他啶(从20%增至46.7%)、头孢曲松(30%增至60%)和头孢哌酮/舒巴坦(10%增至33.3%)，耐药率在7年间增长达1～3倍，克雷伯菌属的产ESBL株对上述3种以及头孢噻肟的耐药率均在50%以上，尤其对头孢他啶的耐药率为62.5%，远不如对大肠埃希菌产ESBL株的抗菌活性，敏感度为81.2%，这是临床学上值得警惕的地方。

    铜绿假单胞菌除对阿米卡星和亚胺南的耐药率分别为40%和44%，对其余品种均呈现高度耐药。7年来亚胺培南和头孢他啶的耐药率(分别为15.4%增至44%和23.1%增至68%)增长均近3倍，失去了对头孢他啶的优势。这与近年来我院各科室大量使用头孢他啶，甚至作为术前常规用药等因素有关，而铜绿假单胞菌又具有染色体介导的可以诱导头孢菌素酶产生的特性，这也加剧了细菌耐药性的增长。此外，铜绿假单胞菌普遍存在氨基糖苷类钝化酶，导致对氨基糖苷类的耐药，对庆大霉素的耐药率已高达76%，以往较敏感的阿米卡星的耐药率亦由23.1%升至40%。铜绿假单胞菌对多种β-内酰胺类抗菌药物呈现固有的耐药性，长期以来将这种耐药性归结为该菌具有异常低通透性外膜。现在已认识到这种耐药性是由于能量依赖的主动外排系统和低通透性外膜协同作用的结果。铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药则是由于此抗菌药物进入细菌的特定膜蛋白通道OprD缺失［12］。

    鲍曼不动杆菌仅对亚胺培南保持高度敏感(90%)，1998年尚未测出耐药株，但2005年已发现2株耐药。对哌拉西林/三唑巴坦相对敏感(敏感率55%)；对其余品种均显示高度耐药，尤其头孢哌酮/舒巴坦(由1998年的0增至2005年的55%)和阿米卡星(由38.9%增至70%)增幅明显。

    用E-test监测细菌耐药性的另一优点是一旦确定为产ESBL菌株，尽管用常规药敏试验测定其MIC值仍在抗菌药物敏感范围内，仍然应在临床上避免使用第三代头孢菌素，甚至加酶抑制剂的复合制剂。

    ESBLs自1983年在德国首次发现以来，在世界各地都有产ESBLs菌株的报道，且逐年上升［13］。细菌产生ESBLs的种类随细菌而异，不同地区ESBLs流行株也有所不同，同一不同病区产ESBLs流行株也可以有差异，Yagi等［14］对26594株大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌研究证实在日本以TOHO-1型ESBLs为主，TEM型少见，在法国SHV［15］则很常见，我国以SHV-1和CTX-M型常见［16］。本次试验大肠埃希菌和克雷伯菌属中的检出率分别为44.4%和53%，稍高于上海朱德妹报道的33.6%和44.2%［17］，北京张永标的报道32.4%和41.1%［18］，第一军医大学的报道34.8%和45.5%［19］，Kucukates报道27.7%和86%［20］，天津刘佳的报道克雷伯菌中检出率为45.9%［21］。

    从以上试验可见，细菌耐药问题值得重视，细菌耐药性监测是必要的，有利于临床医师及时更新细菌耐药性知识，对本地区细菌分布及耐药谱有清晰的了解，便于合理使用抗菌药物，有利于减少细菌耐药性的产生。同时要加强规范使用抗菌药物的培训，以提高对感染性疾病的治疗水平。

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