对照检测病原体单细胞悬液的制作与保存
作者：任兴昌,卢晴晴,陈洪勋
【关键词】 病原体;单细胞悬液；染色
The Preparation and Preservation of Single Cell Suspension of Pathogenic
Key words：Pathogenic；Single cell suspension;Stain
病原体单细胞悬液有广泛的应用前景，尤其在临床实验、病理诊断中更是具有十分重要的作用。由于无论是机器操作还是手工操作均不能保证每张玻片的条件(如时间、剂量、效价程度或其他因素等)相同，到目前为止还没有设立真正意义上的对照的方法，除少数试剂可于片中寻找自身对照外，部分结果阳性、阴性及阳性的度以及结果的准确性较难判定。而单细胞悬液的制作选择各种已知阳性组织、细胞以及病原体标本，制成可以长期保存的含有均匀分散的单细胞悬浮液体对照物质，在进行玻片实验时将相应的对照物质点、涂少许于玻片上，同实验对象一起进行实验，以建立真正的对照，判断的结果准确可靠。为此，我们对与病原体形态检测有关的对照物质的制作与保存做了一些研究探讨。
1 材料与方法
选择我院临床活检取自外阴及宫颈赘生物，10％甲醛固定的尖锐湿疣病例、白色假丝酵母菌培养物(光滑型1个培养皿、粗糙型2个培养皿)、外周血淋巴细胞培养物、肾小管上皮细胞培养物以及取自肾病变组织的肾结核各1例。均进行细胞分散，常规HE染色(即苏木精伊红染色)/Ziehl—Neelsen抗酸杆菌染色，经显微镜镜检后证明单细胞悬液在临床实验与病理镜检中的可行性。
1．1 试剂 由于实验对象的不同，实验所需试剂有所区别。通用试剂1：PBS缓冲溶液;通用试剂2：生理盐水(每整瓶生理盐水+肝素1支)；通用试剂3：10％甲醛溶液;通用试剂4：HE染色剂;通用试剂5：保存液；外周血淋巴细胞培养物所需试剂：红细胞裂解液;外周血淋巴细胞培养物／肾小管上皮细胞培养物所需试剂：70％乙醇溶液;肾结核所需试剂：Ziehl—Neelsen抗酸杆菌染色剂;尖锐湿疣所需试剂：胶原酶Ⅱ。
1．2 实验步骤
1．2．1 白色假丝酵母菌培养物(光滑型／粗糙型)单细胞悬液的制备 将光滑型与粗糙型白色假丝酵母菌分涂布于冷却的培养基上，室温培养24 h。→分别挑取适量的光滑型与粗糙型白色假丝酵母菌加入含肝素的生理盐水中置于震荡器上混匀后，各加入2滴10％甲醛溶液固定30 min。→3 000 r／min离心10 min后，弃上清。→用生理盐水(含肝素)清洗，3 000 r／min离心10 min，弃上清，重复此步骤2次～3次→加1倍～5倍保存液，震荡混匀，4 ℃冰箱保存。→取混合液1滴于玻片，常规HE染色。→烘干，中性树肢封片，显微镜镜检。
1．2.2 肾小管上皮细胞培养物单细胞悬液的制作 将培养物连同液体培养基一起加入50 ml离心管，2 000 r／min离心10 min，去上清。→加入PBS缓冲溶液清洗培养基，2 000 r／min离心10 min，去上清液，重复此步骤2次。→加入适量PBS缓冲溶液，并加入1／10量的70％乙醇溶液进行固定。→2 000 r／min离心10 min，去上清。→加入适量PBS缓冲溶液，2 000 r／min离心10 min，去上清。重复此步骤2次。→加1倍～5倍组织量的保存液，震荡混匀后，4 ℃冰箱保存。→取少许于玻片上，常规HE染色。→烘干，中性树胶封片，显微镜镜检。
1．2．3 肾结核(病变组织已固定)单细胞悬液的制作 取50 ml离心管2支，加入已固定的和机械绞碎的富含结核杆菌的组织。→将已固定的肾结核以3 300 r/min离心15 min，去上清。→加入PBS缓冲溶液清洗，3 300 r／min离心15 min，去上清。→重复此步骤2次～3次。→加1倍～5倍保存液，震荡混匀，4 ℃冰箱保存。→取少许于玻片上，Ziehl?Neelsen抗酸杆菌染色。→烘干，中性树胶封片，显微镜镜检。
1．2．4 10％甲醛固定的尖锐湿疣组织单细胞悬液的制作 取已固定的尖锐湿疣组织，用PBS缓冲溶液漂洗，然后将其切碎成为1 mm2～5 mm2左右的小块，280目筛网过滤。→将过滤后的混合液2 000 r／min，离心10 min，去上清。→加入30倍～50倍组织量的胶原酶Ⅱ，密封。→离心管放入37 ℃恒温箱，每隔30 min振摇一次，消化24 h，→2 000 r／min离心10 min，去上清。→加入PBS缓冲溶液清洗，2 000 r/min离心10 min，去上清。→重复此步骤2次。→加入2．5倍组织量红细胞裂解液，震荡混匀10 min～15 min，进行充分裂解。→2 000 r／min离心10 min，去上清。→加入PBS缓冲溶液清洗，2 000 r／min离心10 min，去上清。→重复此步骤2次。→加入1倍～5倍组织量保存液，震荡混匀，置于4 ℃冰箱保存。→取少许于玻片上，常规HE染色。→烘干，中性树胶封片，显微镜镜检。
1．2.5 外周血淋巴细胞培养物单细胞悬液制作 取适量外周血淋巴细胞培养物于50 ml离心管中，加入2．5倍组织量的红细胞裂解液进行红细胞裂解。→震荡器混匀10 min～15 min，充分裂解。→3 000 r／min离心10 min后，去上清。加入2．5倍红细胞裂解液，震荡混匀10 min～15 min，重复此步骤2次。→3 000 r／min离心10 min，去上清。→加适量生理盐水(含肝素)，加入1／5倍组织量的70％乙醇溶液固定30 min。→3 000 r/min离心10 min，去上清。→加适量生理盐水(含肝素)，加2滴～3滴10％甲醛固定10 min。→3 000 r／min离心10 min，去上清。→生理盐水(含肝素)3 000 r／min离心10 min，去上清。→重复此步骤2次。→加入1倍～5倍保存液，震荡混匀，4 ℃冰箱保存。→取少许于玻片上，常规HE染色。→烘干，中性树胶封片，显微镜镜检。
2 实验结果
将不同的实验材料做成单细胞悬液，按照一定的浓度比例(一般是1∶1～1∶5)保存在保存液中。镜检后的结果基本有效的反映了材料的真实情况。
2．1 白色假丝酵母菌单细胞悬液 制作后的白色假丝酵母单细胞悬液，经过常规HE染色后镜检，可以看到大量的菌体以一定的均匀度分布于镜下，细胞分散良好，染色均匀，大大提高了观察效率。
2．2 肾小管上皮细胞培养物单细胞悬液 肾小管上皮细胞培养物是很好的实验材料，将其制成单细胞悬液后，经常规HE染色后镜检，可以看见肾小管上皮细胞均匀分布于玻片上，形态清楚，镜检效果良好。
2．3 肾结核单细胞悬液 肾结核是从肾结核患者的肾病变组织中直接取出，它含有大量的干酪类物质，在一定程度上会影响对肾结核杆菌的镜检效果。将其制成单细胞悬液，经Ziehl?Neelsen抗酸杆菌染色后，可见大量的杆菌分布于玻片上，杂质大大减少，能很好的进行镜检。
2．4 10％甲醛固定的尖锐湿疣组织单细胞悬液 尖锐湿疣组织经切碎过滤后加入胶原酶Ⅱ，有效消化细胞间质，从而达到分散细胞的目的。常规HE染色后镜检，可观察到细胞呈单个或小型细胞团块分布于玻片上，能较好的进行镜检。
2．5 外周血淋巴细胞培养物单细胞悬液 制作后的外周血淋巴细胞培养物单细胞悬液，经过常规HE染色后镜检，可以看见部分淋巴细胞以及部分红细胞存在，细胞分散情况一般。红细胞的存在干扰了对淋巴细胞的镜检效果，镜检效果一般。
3 讨论
本实验是由一组实验所构成的，它的实验对象包括培养物和非培养物，通过对其单细胞悬液的制作证明实验的实际可操作性，为临床诊断及医疗方案的判断和选择奠定了一定的基础。实验中采用了多种实验对象，是为能探索各种病原体阳性、阴性对照物质的单细胞制作方法，也是为了能在实验进行的同时有利于发现各个方面的问题所在。培养物的单细胞悬液制作简单方便，需要注意的是离心速度。离心速度过小或时间过短，组织细胞容易悬浮，造成不必要的损失；而离心速度过大或时间过长，会挤压细胞造成细胞凝集重新变成团块状，不利于均匀分散悬浮［1］。相对的，非培养物病原体单细胞悬液的制作就比较麻烦［2］。尤其是作为实体组织的尖锐湿疣组织，它需要注意的事项比较多。首先是组织的切碎，人工或机器的机械法分离都会在一定程度上损伤组织细胞，造成大量细胞碎片［3］。其次，由于经过过滤，此时的液体中既含有单个的细胞和细胞团块，也包含了一些数量庞大的细胞碎片。因此在离心时要注意离心的速度，太慢会造成细胞的悬浮，既不能有效去除碎片，更损失有用的细胞；同样，太快会挤压细胞造成过度凝集，而且还会使得在最后的检测中发现大量残余的细胞碎片，影响结果；胶原酶Ⅱ的消化效果并不是很称心，不能做到将细胞完全分离的程度；在胶原酶作用期间要注意无菌工作，以免在37 ℃恒温箱中消化的过程中滋生一些不必要的细菌，影响到最后的检测；细胞在保存液中的状态，不同的细胞其保存液的浓度不同，这就要求调试到最适合浓度以使得细胞在液体中能保持单个的均匀分散的状态［4］。从这一系列实验的结果来看，病原体单细胞悬液还是具有较强的实际可操作性。但其制作过程还需要不断的进步，特别是针对组织的分离方面。
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