大鼠肠巨噬细胞肠上皮细胞分泌TNFa的规律及药物作用的研究
作者：温志新，王辉，陈海龙，范琦，李文利
【摘要】 目的：本实验利用体外单独培养的肠巨噬细胞、肠上皮细胞及二者混合细胞,通过脂多糖(LPS)刺激及地塞米松(DEX)、TNFa单克隆抗体及复方清下汤作用，探讨肠巨噬细胞、肠上皮细胞的TNFa分泌及以上三种药物的影响。方法：体外培养肠巨噬细胞、肠上皮细胞及二者混合细胞，三种细胞除对照组外，都用LPS诱导，同时一部分细胞再经DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤分别处理，培养６ h后取上清液。应用放免法检测TNFa。结果：正常肠巨噬细胞可分泌少量的TNFa。LPS诱导组分泌显著增加，DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤处理组与脂多糖诱导组相比分泌显著降低。正常肠上皮细胞可分泌少量的TNFa，但LPS诱导组与正常对照组及药物处理组与LPS诱导组之间差异无显著性。混合细胞结果与肠巨噬细胞相同。结论：肠道屏障受破坏时，门静脉血中TNFa明显增高，这主要与肠巨噬细胞在内毒素刺激下分泌增多有关，与肠上皮细胞无明显关系。DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤均可抑制肠巨噬细胞分泌这三种物质。DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤具有肠黏膜屏障的保护作用。
【关键词】 肠巨噬细胞；肠上皮细胞；肿瘤坏死因子；肠道屏障
TNFa是一个具有１５７个氨基酸的蛋白,是机体的早期炎性介质,在炎性介子连锁反应中起重要作用。本实验利用体外单独培养的肠巨噬细胞、单独肠上皮细胞及二者混合的细胞,通过脂多糖(LPS)刺激及地塞米松(DEX)、TNFa单克隆抗体及复方清下汤作用探讨肠巨噬细胞及肠上皮细胞TNFa的分泌及以上三种药物的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 1SD雄性健康大鼠，220 g～250 g。由大连医科大学实验动物中心提供。DMEM培养基、RPMI 1640培养基（GIBCO公司）、等渗细胞分离液（Percoll solution由1份10xDulbecco's磷酸盐缓冲生理盐水和9份细胞分离液构成。不同浓度的Percoll溶液用1xDulbecco's磷酸盐缓冲生理盐水稀释）、胶原酶IV(Collagenase Iv SIGMA公司)、大鼠TNFa放免检测试剂盒（解放军总科技开发中心放免所）、NO检测试剂盒（北京晶美生物公司）。中药：复方清下汤，由大黄、芒硝、枳实、川朴等10位中药组成，经抽提、过滤制成精制药液。
1.2 方法
1.2.1 组织制备 肠上皮细胞分离［1］：动物以密闭CO2笼处死,迅速取全肠，用50 ml冷PBS(pH=7.4)冲洗肠腔。纵向剖开，置入含0.1%EDTA的无钙、镁Hanks平衡盐溶液中，37 ℃水浴中振荡20 min后，收集上清，用于分离肠上皮细胞；肠巨噬细胞的分离［1］：所取组织继续以HBSS/EDTA消化40 min，然后用５％胶原酶Ⅳ的含钙、镁的Hanks液继续振荡消化2 h。所得细胞悬液以53 μm尼龙网过滤得单个细胞；分离肠上皮细胞：第一次EDTA处理的细胞悬液以HBSS洗2遍，悬于40%等渗的细胞分离液中。1 500 rpm离心，4 ℃，15 min。收集上层细胞(含有98%肠上皮细胞)，用HBSS洗3遍，以DMEM调细胞浓度为4×105/ml。用胎盘蓝染色，细胞活力为80%。以碱性磷酸酶标记的单克隆抗体进行细胞染色，肠上皮细胞纯度为98%(染色阳性的为肠巨噬细胞)。分离肠巨噬细胞：经胶原酶处理的细胞悬液，以HBSS洗涤。悬于50%等渗的细胞分离液后，离心，2 000 rpm，4 ℃，15 min。收集细胞沉淀，以无钙、镁的HBSS洗3遍，RPMI 1640培养基调细胞浓度为4×105/ml。
1.2.2 实验分组 肠巨噬细胞组：取24孔培养板，每孔加入肠巨噬细胞悬液0.5 ml及DMEM培养基0.5 ml，取三孔作正常对照，其余各取三孔分别加入４０ μl LPS终浓度(10 ug/ml）,20 μl （LPS终浓度为10 ug/ml）及20 μl DEX(终浓度为10?6 mmol/l），20 μl LPS(终浓度10 ug/ml）及20 μl TNFa单克隆抗体（终浓度10?1 mmol/l），20 μl LPS(终浓度10 ug/ml）及20 μl复方清下汤（终浓度1∶100）。对照组加４０ μl生理盐水；肠上皮细胞组：24孔培养板，每孔加入肠上皮细胞悬液0.5 ml及PRMI 1640培养基0.5 ml。取三孔作为正常对照，其余各取三孔分别加入４０ μl LPS(终浓度10 ug/ml）,20 μl LPS(终浓度10 ug/ml）及20 μl DEX(终浓度10?6 mmol/l），20 μl LPS(终浓度10 ug/ml）及20 μl复方清下汤（终浓度1∶100）。对照组加４０ μl生理盐水；肠巨噬细胞及肠上皮细胞混合组：取24孔培养板，每孔加入肠巨噬细胞悬液0.5 ml及肠上皮细胞悬液0.5 ml。取三孔作为正常对照，其余各取三孔分别加入４０ μl LPS(终浓度10 μg/ml）,20 μl LPS(终浓度10 μg/ml）及20 μl DEX(终浓度10?6 mmol/l），20 μl LPS(终浓度10 μg/ml）及20 μl TNFa单克隆抗体（终浓度10?1 mmol/l），20 μl LPS(终浓度10 μg/ml）及20 μl复方清下汤（终浓度1∶100）。对照组加４０ μl生理盐水。各培养板于37 ℃ 5% CO2培养箱中培养6 h，取上清液检测TNFa。
1.2.3 检测方法 TNFa检测：放免法，按试剂盒操作。
1.2.4 统计方法 实验数据用±s表示,结果应用SPSS10.0进行统计分析。
2 结果
TNFa浓度由表1可见,肠巨噬细胞正常可分泌少量TNFa,经LPS刺激后分泌量明显增加（P＜0.01）。DEX处理后TNFa明显下降（P＜0.01）。单克隆抗体处理组及复方清下汤处理组也呈下降趋势（P＜0.05）。肠上皮细胞各组无明显变化，混合细胞经LPS诱导后，TNFa浓度显著增加，各药物处理组都比诱导组显著降低(P＜0.01或P＜0.05)。
表1 培养6 h后上清夜中TNFa浓度（略）
3 讨论
肠巨噬细胞及肠上皮细胞是肠道屏障的重要组成部分［3］,它们功能的稳定对维持肠道屏障功能具有重要作用。肠道屏障受损时,各自的生理功能也会出现相应的改变。本实验从TNFa的分泌情况来观察内毒素诱导下的肠巨噬细胞及肠上皮细胞的功能改变,并探讨药物的保护作用。TNFa是一个具有１５７个氨基酸的蛋白，主要来源于巨噬细胞。正常时不易检出，TNFa的释放是机体对各种外源或内源性刺激的反应。革兰阴性菌胞壁成分特别是内毒素LPS是TNFa释放的强有力刺激物，是机体的早期炎性介质［4］。本实验表明，肠道屏障受破坏时，肠组织中TNFa的增高是肠巨噬细胞受内毒素刺激活化的结果，肠上皮细胞则无明显作用。应用DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤处理后，可明显抑制肠巨噬细胞TNFa的产生。可见DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤对保护肠道屏障，抑制早期炎性反应有明显作用。综上所述,肠道屏障受损时,肠巨噬细胞活化,分泌TNFa显著增加,成为门脉血清中这种物质浓度增高的重要原因之一。肠上皮细胞在这一现象中没有明显作用。DEX、TNFa单克隆抗体及复方清下汤均有保护肠道屏障的作用。这为我们临床上保护肠黏膜、预防肠源性感染提供药物。
【参考】
［1］ Corak.ogle.The production of Tumor Necrosis Factor.Interleukin?1,Interleukin?6 and prostaglandin E2 by Isolated enterolytes and Gut Macrophages:Effect of Lipopolysaccharide and Thermal Injury［J］.Journal of Burn care & Rehabilitation.1994,15:470?477.
［2］ Kenji Takagi.Sensitive colorimetric assay of serum diamine oxidase［J］.Clinica Chimica Acta， 1994，226:67?75.
［3］ 袁建成.肿瘤坏死因子mRNA在严重烫伤大鼠小肠中的表达及细胞定位的研究［J］．中华整形烧伤外科杂志，１９９６，１２：１６３?１６６.
［4］ 陆立.肿瘤坏死因子与炎症性肠病［J］.国外医学，消比系疾病分册,1998,18(1):9?12.
