Th1/Th2类细胞因子对哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子表达的影响

             作者：代继宏，王永红，何海霞 

【摘要】  目的：初步探讨IL?13和IFN?γ对支气管哮喘大鼠脾淋巴细胞神经生长因子NGF表达的影响. 方法： 建立Wistar大鼠哮喘模型，分离脾淋巴细胞并培养，通过逆转录?聚合酶链反应(RT?PCR)半定量法测定NGF mRNA的基础，12 h， 24 h水平，并观察予以干扰素(IFN?γ)和白细胞介素?13(IL?13)干预后NGF mRNA表达的情况. 结果： 哮喘大鼠脾淋巴细胞在基础状态下具有表达NGF mRNA的功能，并在ConA刺激下呈时间依赖性增强，IL?13组随着干预时间的延长基础NGF mRNA表达量逐渐升高，呈现时间和浓度依赖性，并且至12 h后分别高于各时间点的空白对照组(均P<0.01). 而随着IFN?γ干预浓度的依次增高，NGF mRNA表达相对值却逐渐降低，也表现出浓度和时间依赖特征. 结论： 在哮喘中Th2类细胞因子IL?13可上调淋巴细胞NGF mRNA表达，Th1类细胞因子IFN?γ可下调淋巴细胞NGF mRNA表达，两者均呈时间和浓度依赖性；Th1/ Th2类细胞因子免疫失衡可能通过调控NGF mRNA表达间接促进其诱导神经源性气道炎症.

【关键词】  哮喘；神经生长因子；白细胞介素?13；干扰素Ⅱ型

     0引言

    　　哮喘是严重威胁公众健康的疾病，目前该病的病因、发病机制还不十分清楚，相关研究已经证实在哮喘发病过程中，T细胞亚群(特别是Th1/Th2)功能失衡在哮喘发病中有重要作用. 白介素?13(IL?13)和γ?干扰素(IFN?γ)分别是Th2和Th1效应细胞的细胞因子，在哮喘发病机制中，两者之间的不平衡是引起免疫球蛋白?E(IgE)产生异常和哮喘发病的重要因素，即Th2细胞占优势的反应导致一系列由IgE介导的变应性炎症［1］. 然而，在Th1/Th2失衡中占主导作用的免疫细胞与神经元的相互作用机制仍不清楚.

    　　神经生长因子(nerve growth factor， NGF)是神经营养因子家族中的成员之一，其主要功能是调控神经元的生长与分化. 研究表明，NGF作为神经可塑性调控因子，通过诱导神经源性炎症反应参与哮喘发病［2］. 我们通过建立大鼠哮喘模型，探讨大鼠体内Th1/Th2免疫失衡和神经源性炎症之间的关系.

     1材料和方法

    1.1材料4只雄性Wistar大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，鼠龄4～6 wk，体质量120～200 g，饲养1 wk后建立大鼠哮喘模型. 大鼠IL?13和IFN?γ(上海生工生物工程技术服务有限公司合成)；Ficoll?Hypaque分层液及刀豆素(ConA)购于美国Sigma公司;总RNA抽提试剂盒购于华美生物工程有限公司；逆转录试剂盒购于Promega公司；Taq酶购于TaKaRa公司；Trizol试剂购于美国Molecular Research Center；NGF的ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司. PE4500 PCR热循环仪系美国Sigma公司出品；Avant 30低温高速离心机和Du?70全自动紫外分光光度计系美国Beckman公司出品.

    1.2方法

    1.2.1哮喘模型的建立每只大鼠腹腔内注射抗原液1mL(其中含鸡卵蛋白100 mg，灭活百日咳杆菌疫菌5×109个和氢氧化铝干粉100 mg)致敏，2 wk后开始用超声雾化器每日给予10 g/L鸡卵蛋白雾化吸入60 min激发哮喘，观察症状，连续2 wk，建立哮喘模型［3］. 取肺组织行病理检测.

    1.2.2细胞分离、培养及干预

    1.2.2.1脾淋巴细胞分离以颈椎脱臼法处死大鼠，放入盛75 mL/L乙醇的烧杯中浸泡2～3 min后置超净工作台上，用无菌眼科剪和眼科组织弯钳取脾，并置于盛有冷D?Hanks液(10 mL)培养皿中的筛网上，剪成2～3段，用2 mL注射针芯捻碎. 将细胞悬液移入10 mL离心管中，离心(1500 r/min×5 min)，弃上清后加入6 mL Tris?NHCl破坏红细胞，用吸管吹打混匀后室温下放置5 min，离心(1500 r/min×5 min)，弃上清，D?Hanks液重悬细胞；取5 mL Fieoll?Hypaque分层液(比重为1.087)于另一离心管底部，将细胞悬液轻铺分层液表面离心（400  r/min×20 min），吸取单核细胞层；D?Hanks液洗涤细胞3次，加RPMI?l640培养液10 mL悬浮细胞，将脾单核细胞悬液移入培养皿中，置37℃培养箱中贴壁1 h，使单核/巨噬细胞黏附于玻璃壁上，用毛细吸管吸出未贴壁的淋巴细胞悬液. 取100 μL脾淋巴细胞悬液稀释后用0.4 g/L的台盼蓝染色，计数并观察细胞活力；调整脾细胞浓度为5×1010/L.

    1.2.2.2脾淋巴细胞培养孵育及干预脾淋巴细胞以终浓度5×1010/L的密度接种于24孔培养板中，培养在含有100 mL小牛血清、青霉素、链霉素各1万U／L，ConA为10 kg/L的1640细胞培养基中，每孔细胞总体系均为1 mL，置于37℃，50 mL/L CO2的培养箱中培养. 不同时间干预实验：分为IL?13组(含IL?13终浓度为50 μg/L)、IFN?γ组(IFN?γ终浓度为10 μg/L)、空白对照组(仅含上述培基)，每组20个复孔. 分别于细胞培养0，12，24，36，48 h时各留取4孔标本检测. 不同浓度干预实验：IL?13干预组浓度分别为10 μg/L(低浓度亚组)，50 μg/L(中浓度亚组)，100 μg/L(高浓度亚组)［4］；IFN?γ干预组浓度分别为1 μg/L(低浓度亚组)，10 μg/L(中浓度亚组)，50 μg/L(高浓度亚组)［7］；两组采用同一空白对照组，即IL?13和IFN?γ浓度均为0 μg/L，每组设4个复孔，7组共28孔，刺激24 h留取标本. 标本离心后细胞沉淀用于半定量检测NGF mRNA.

    1.2.2.3RT?PCR方法检测脾淋巴细胞NGF mRNA表达按照GenBank序列设计引物［5］：NGF上游引物，5′?TCCAGGTGCATAGCGTAATG?3′，下游引物，5′?CTCCGGTG AGTCCTGTTGAA?3′，扩增片段为376 bp；β?actin上游引物，5′?ACCCACACTG TGCCCATCTAT?3′；下游引物，5′?GGACTCATCGTACTCCTGCTTG?3′，扩增片段为618 bp. 使用Trizol试剂从脾淋巴细胞中抽提总RNA. 2 μg RNA经Oligo(dT)引物和AMV逆转录酶合成cDNA. 2 μL cDNA样品加入10×PCR标准缓冲液2.5 μL，10 mmol/L的dNTPs 0.5 L，10 μmol/L上下游引物各1 μL，25 mmol/L氯化镁(MgCl2)2 μL，1万U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，加DEPC至总反应体系25 μL. PCR反应条件：94℃  5 min，94℃  30 s，52℃ 45 s，72℃ 1 min，共35个循环，72℃延伸10 min. 扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶中电泳后，将凝胶在Eagle Eye II图像处理系统上分析出每个PCR扩增产物DNA带的A值，以β?actin PCR产物的A值为内对照，NGF产物与β?actin的A值的比值百分比(％)对NGF mRNA的含量行半定量分析.

    统计学处理： 所有数据用SPSS11.5统计软件处理. 实验结果用x±s表示，多个样本均数比较采用方差分析，多样本均数间两两比较采用LSD?t检验，P<0.05为有统计学差异.

    2结果

    2.1哮喘大鼠模型的建立大鼠在抗原激发30~60 min后则可出现呼吸急促、腹肌收缩、轻度发绀、行动迟缓及反应迟钝等；肺组织病理示大鼠支气管管壁周围有较多淋巴细胞、嗜酸性粒细胞浸润，还可见支气管气道上皮脱落、杯状细胞增生、黏液栓增多等改变.

    2.2哮喘大鼠脾淋巴细胞表达NGF mRNA的基础水平及时间相关性空白对照组培养脾淋巴细胞0，12，24，48 h时基础NGF mRNA表达水平随着时间的延长逐渐升高， IL?13组随着时间的延长基础NGF mRNA表达量逐渐升高，并高于同时间空白时间组（P<0.05）. 相反，IFN?γ组的NGF mRNA水平随时间逐渐下降，并均低于同时间空白对照组（P<0.01，表1）. 表1 不同时间IL?13组和IFN?γ组NGF mRNA表达相对值比较

    2.3Th1/Th2类细胞因子对哮喘大鼠脾淋巴细胞NGF mRNA表达的影响随着IL?13干预浓度的依次增高，NGF mRNA表达相对值逐渐升高，并且分别与前一梯度低浓度处理组相比较有统计学差异(均P<0.05)；而随着IFN?γ干预浓度的依次增高，NGF mRNA表达相对值却逐渐降低(表2)，两者均表现出浓度依赖性. 表2不同浓度IL?13和IFN?γ干预组NGF mRNA表达相对值变化

    3讨论

    哮喘理论认为，体内Th1/Th2比例失调是导致哮喘发病的重要原因［8］. 而Th1/Th2免疫失衡参与哮喘的发生需要Th1/Th2细胞因子的功能活性来实现［5-7］. IL?13是由多种炎症细胞产生,调节T 淋巴细胞的增殖和分化,肺内IL?13 被认为是关键的细胞因子调节哮喘发病时异常的免疫过程［10］. IFN?γ则被认为是一种非常重要的抗支气管哮喘的Th1淋巴因子［8-9］. IL?13可抑制IL?12的产生. IL?12的主要功能是促使Th0细胞向Th1细胞分化，抑制其向Th2细胞分化，并刺激这些细胞产生IFN?γ，内源性IL?12能阻止过敏性炎症发生，外源性IL?12能抑制易感小鼠过敏性气道炎症，降低Th2细胞因子的产生和过敏性哮喘的发生率. IL?13上调单核/巨噬细胞中半胱氨酰白三烯1受体的mRNA和蛋白表达，增强白三烯D4的应答，导致哮喘的发生［10］. 如同IL?4的作用，IL?13通过下调单核细胞产生IL?12而抑制Th1细胞，有利于形成Th2应答，从而通过Th2分泌的细胞因子，如IL?5，增强嗜酸性粒细胞的活化和浸润.

    　　IFN?γ和IL?13分别作为Th1和Th2细胞的特征性细胞因子，分别干预致敏哮喘大鼠的脾淋巴细胞，通过检测细胞的NGF mRNA表达的变化来间接反映Th1/Th2的免疫应答失衡对NGF的影响. 结果发现，除了参与Th1/Th2免疫失衡外，Th1细胞因子IL?13可显著促进哮喘大鼠脾淋巴细胞NGF的表达并呈浓度和时间依赖性；而Th1细胞因子IFN?γ明显下调NGF的表达也呈浓度和时间依赖性. 这似乎表明在哮喘中Th2免疫活性增强，产量增多和功能增强的IL?13促进淋巴细胞自身NGF mRNA表达的效应也可能增强；相反，Th1免疫活性减弱，IFN?γ下调NGF的表达也可能被阻抑，Th1/Th2免疫失衡最终会导致淋巴细胞中NGF的表达增强. 因此，通过增强NGF的表达，Th1/Th2类细胞因子免疫失衡可能间接放大由NGF诱导的哮喘另一发病机制：气道神经源性炎症.

    　　NGF可通过以上正反馈的模式促进和放大哮喘的Th1/Th2免疫失衡，Th1/Th2类细胞因子免疫失衡也以正反馈的模式调控NGF的表达，进而可促进NGF介导的神经源性炎症. 故Th1/Th2免疫失衡性和神经源性气道炎症作为哮喘两个重要的发病机制，在哮喘发生发展中，是相互作用的病理过程.

【】
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