Ad?HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应

          作者：哈小琴，吕同德，赵治华，唐瑜，昌业伟  

【摘要】  目的： 观察Ad?HGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ细胞）的转染表达及增殖效应. 方法： 以不同转染强度（50，100，200 MOI）Ad?GFP转染原代培养大鼠ATⅡ细胞，感染后48 h用流式细胞仪检测转染效率. 并以最佳感染强度Ad?HGF转染ATⅡ细胞，ELISA方法检测转染后48, 72 h上清中HGF的表达水平. 用MTT法检测表达产物对肺泡上皮细胞的效应. 结果： 感染强度为100 MOI时，对ATⅡ细胞的转染效率已达89.61％，以100 MOI的Ad?HGF转染6×105细胞后48, 72 h上清中HGF的表达分别为(249.4±1.8) ng和(168.0±26.1)ng，且表达产物对ATⅡ细胞有明显的促增殖作用. 结论： Ad?HGF可有效转染ATⅡ细胞并在细胞中表达，表达产物对该细胞有明显的促增殖作用.

【关键词】  Ad?HGF；肺泡Ⅱ型上皮细胞；转染；基因表达；细胞增殖

      0引言

    　　肺泡上皮细胞是覆盖于肺泡表面的一层上皮细胞，分为Ⅰ型和Ⅱ型. 其中肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ cell, ATⅡ细胞)具有重要的功能,当受到各种刺激时, ATⅡ细胞可增生并修复已损伤的上皮细胞,起着肺泡上皮干细胞的作用［1］. 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）是一多功能生长因子，在生理状态下可促进肺上皮细胞的发生、管腔形成及肺支气管上皮细胞的增生，HGF也可促进急性肺损伤的肺上皮组织增生和修复［2］. 我们在前期构建的携带人HGF基因的重组腺病毒（Ad?HGF）［3］基础上，观察Ad?HGF对ATⅡ细胞的转染表达及增殖效应，为Ad?HGF肺损伤提供依据.

    1材料和方法

    1.1材料Ad?HGF, 携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（Ad?GFP）由军事医学院二所三室提供，本课题组构建［3］；抗人HGF mAb（R&D），重组人HGF蛋白纯品（R&D）,DMEM(Gibco),胎牛血清(Gibco)，碱性磷酸酶显色试剂（北京中山生物技术有限公司），MTT(BBI)；Wistar大鼠（甘肃省中医学院，清洁级，180～230 g）.

    1.2方法

    1.2.1大鼠ATⅡ细胞原代培养Wistar大鼠腹腔注射肝素（4 U/g）和异戊巴比妥钠（100 mg/100 g）,无菌分离出气管及肺置于生理盐水中，用生理盐水冲洗肺动脉两次后行肺支气管插管，用8～15 mL溶液A(1.3 mmol/L NaCl, 5.2  mmol/L KCl, 10.6 mmol/L Hepes, 2.6 mmol/L Na2HPO4, 10 mmol/L D?Glucose, pH 7.4)冲洗2～3次后，用2.5 g/L胰酶冲洗1次，再将胰酶灌满肺（约8～15 mL）,37℃消化20～30 min;剪碎肺组织置入含250 mL/L胎牛血清的溶液B(A液加入1.9 mmol/L CaCl2, 1.29 mmol/L MgSO4)中, 37℃振摇4 min后过100目和200目细胞筛,并用Percoll分离液进行低温（10℃）梯度离心，250 g离心20 min，收集细胞接种于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，37℃  50 mL/L  CO2培养1 h后将未贴细胞转至另一培养瓶继续培养，48 h时对细胞进行碱性磷酸酶染色（改良Gomori氏钙钴法）［4］鉴定.

    1.2.2重组腺病毒对原代培养AT Ⅱ细胞的转染将第二代生长旺盛的AT Ⅱ细胞接种至6孔细胞培养板，每孔6×105细胞，次日用不同感染强度（50，100，200 MOI）的Ad?GFP感染，感染后48 h用流式细胞仪检测转染效率，选择对原代培养ATⅡ细胞的最佳感染强度.

    1.2.3腺病毒介导HGF在ATⅡ细胞中的表达将生长旺盛的原代培养ATⅡ细胞接种至6孔细胞培养板，每孔6×105细胞，24 h后用最佳感染强度的Ad?HGF感染，37℃培养48, 72 h时分别收集上清. 用ELISA检测HGF表达量.

    1.2.4HGF表达产物对ATⅡ细胞的作用采用MTT法测定细胞增殖活性. 将原代培养ATⅡ细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为5×103个. 12 h后吸弃原培养液，每孔加入100 μL 无血清DMEM,HGF表达上清所加的量分别占培养总体积的5%(80 pg)，10%(160 pg), 15%(240 pg),20%(320 pg),25%(400 pg),40%(640 pg)和50%(800 pg). 72 h后每孔加入20 μL MTT, 37℃孵育4 h后，弃上清用DMSO溶解沉淀，测其波长在560 nm 处A值.

    2结果

    2.1原代培养大鼠ATⅡ细胞酶消化及贴壁培养法培养大鼠ATⅡ细胞，48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色，胞质中可见灰黑以至深黑颗粒状沉淀(图1).

    2.2重组腺病毒可有效转染ATⅡ细胞以不同MOI的Ad?GFP（50, 100, 200 pfu/细胞）感染ATⅡ细胞，随着病毒剂量的加大，其转染率提高（图2）. 当MOI为100 pfu/细胞时，转染率已近90%，表明ATⅡ细胞对重组腺病毒高度敏感；当MOI再加大时，腺病毒对细胞有一定毒性，细胞有少量漂浮现象. ATⅡ细胞感染Ad?GFP 12 h时，即可在荧光显微镜下观察到大量GFP表达阳性的细胞，随时间的推移，阳性细胞比例继续增多，GFP表达量也升高，48～72 h 时达高峰（图3），此后GFP表达量呈下降趋势，直至第10日时仍可见少量阳性细胞.

    2.3重组腺病毒介导人HGF基因在肺泡上皮细胞中的表达用ELISA方法检测Ad?HGF感染肺泡上皮细胞后HGF的表达，结果感染后48 h表达量约为(249.4±1.8) ng/6×105细胞；至72 h时仍有较高的表达［（168.0±26.1）ng/6×105细胞］. 这说明腺病毒介导的人HGF基因可在肺泡上皮细胞中高效表达.

    2.4HGF表达产物对ATⅡ细胞的增殖刺激活性采用MTT法分析了不同剂量HGF表达产物对原代培养ATⅡ细胞的作用，结果表明原代培养ATⅡ细胞表达的上清，有明显刺激ATⅡ细胞增殖的活性(P<0.05)，而且有剂量效应关系. 加入20%（320 pg）表达上清时刺激活性达高峰，剂量加大活性不再增加(图4).

    3讨论

    　　肺泡Ⅰ型上皮细胞(ATⅠ细胞)和ATⅡ细胞连接于同一基底膜上，构成肺上皮屏障，其功能在于清除肺泡内过多液体，保持肺泡相对干燥，以维持肺脏正常的气体交换功能. ATⅡ细胞占整个肺泡细胞的16%，但仅占肺泡总面积的5%，常集中于肺泡表面的凹陷处和肺泡角；每个肺泡约有5～8个ATⅡ细胞. ATⅡ细胞的功能包括：合成分泌PS；跨膜运输能力；参与氧化代谢；前体细胞功能；作为某些激素的靶细胞. ATⅡ细胞是肺泡上皮细胞的干细胞，既能增殖成新的ATⅡ细胞，又可以在必要时分化成ATⅠ细胞，两种细胞在肺泡中的比例对于保持肺正常功能至关重要. ATⅡ细胞通过代替损伤的细胞来恢复正常肺组织的结构与功能，参与肺泡上皮的修复过程. ATⅡ细胞对于维持正常肺水转运，损伤后肺泡上皮细胞的增殖，保持肺泡壁完整性和保证正常气体交换都有重要作用. ATⅡ细胞快速增殖是保持肺泡连续性，维护屏障功能和限制气道高反应性的关键因素［5］.

    　　HGF是一多功能生长因子，HGF及其受体c?met在肺发生时对肺上皮和间质细胞之间的相互作用有着重要的调节功能，对肺上皮组织形成起着重要的作用. 除促进肺发生外，HGF还可促进肺支气管上皮细胞的增生，促进上皮细胞的管腔形成［6-7］，总之，在生理状态下HGF可促进肺上皮细胞的发生，管腔形成及肺支气管上皮细胞的增生，这些作用为HGF肺疾患奠定了基础.

    Morimoto等［8］观察了HGF对急性肺炎的治疗作用，结果表明急性肺损伤后内源性HGF活性明显升高, 被认为这种内因性的HGF升高是血管内皮细胞、成纤维细胞、肺泡巨噬细胞等肺间质细胞产生，通过旁分泌途径供给肺内各种上皮细胞，从而修复损伤的肺组织. Abednazari等［9］类似的方法做成小鼠急性肺炎模型后，由尾静脉每日注射重组的HGF 100 μg进行治疗，与对照组相比，反映组织增生指标的DNA合成参数在支气管上皮细胞可增加3倍，在肺泡II型上皮可升高2倍，这说明HGF可促进急性肺炎时损伤的肺上皮组织增生和修复，从而有望成为治疗急性肺炎的有效药物.

    　　但因HGF半衰期较短，因而用蛋白制剂给药需要丰富的产量和反复应用才能维持局部较高的药物浓度，有时即使重复应用也难以达到有效浓度［10］；而且应用蛋白制剂花费较高；另外，目前的纯化工艺对于人药用级生长因子蛋白的纯化还不是非常成熟，给临床治疗带来很大不便. 故本实验采用近年来兴起的一种新的治疗模式基因治疗的方法，该法通过将HGF基因采用细胞内质粒DNA同源重组法构建到腺病毒载体上(Ad?HGF)，Ad?HGF 局部应用使HGF基因在肺组织表达，使肺组织成为“微型的药物工厂”，持续分泌一定时间的重组蛋白HGF，以达到防治肺疾患的目的，以减少给药次数，降低成本等，另外，腺病毒嗜呼吸系统组织，局部应用能在局部表达. 本文旨在欲利用基因治疗的方法，将HGF应用于肺损伤的治疗，首先在体外观察其对ATⅡ细胞的转染表达及活性，结果表明Ad?HGF可有效转染ATⅡ细胞并在细胞中表达，表达产物对该细胞有明显的促增殖作用. 进一步的研究表明Ad?HGF可有效治疗博来霉素致大鼠肺损伤（另文报道），从而提示Ad?HGF可能会为治疗肺损伤的有效药物.

【】
  ［1］ 周莉，金克炜. 肺泡II型上皮细胞及其分离鉴定与原代培养［J］.肺癌杂志, 2003，6（3）：236-238.

［2］ Myerburg MM, Latoche JD, McKenna EE, et al. Hepatocyte growth factor and other fibroblast secretions modulate the phenotype of human bronchial epithelial cells ［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007,292(6): L1352-1360.

［3］哈小琴，吴祖泽，吕同德，等. 携带人肝细胞生长因子基因重组腺病毒的构建与制备［J］. 药物生物技术，2005, 12(2):71-75.

［4］ 杨景山. 医学细胞化学与细胞生物技术［M］. 北京: 北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，2000: 41.

［5］ 毛宝龄，钱桂生，陈正堂. 急性呼吸窘迫综合征［M］. 北京：人民卫生出版社，2002: 58.

［6］ Stern JB, Jaffre S, Dehoux M, et al. Keratinocyte growth factor and hepatocyte growth factor : their roles in alveolar epithelial repair［J］. Rev Mal Respir, 2003, 20 (6Pt1): 896-903.

［7］ Yamamoto H, Yun EJ, Gerber HP, et al. Epithelial?vascular cross talk mediated by VEGF?A and HGF signaling directs primary septae formation during distal lung morphogenesis［J］. Dev Biol, 2007, 308(1): 44-53.

［8］ Morimoto K, Amano H, Sonoda F, et al. Alveolar macrophages that phagocytose apoptotic neutrophils produce hepatocyte growth factor during bacterial pneumonia in mice［J］.Am J Respir Cell Mol Biol, 2001, 24(5): 608-615.

［9］ Abednazari H, Xu J, Millinger E, et al. Hepatocyte growth factor is a better indicator of therapeutic response than C?reactive protein within the first day of treatment in pneumonia ［J］. Chemotherapy, 2006, 52(5): 260-263.

［10］ Uematsu Y, Fujise N, Kohsaka K, et al. Effective administration route for the deleted form of hepatocyte growth factor to exert its pharmacological effects ［J］. J Pharm Sci, 1999, 88(1): 131-135.