冠心病患者胱硫醚β?合酶基因 G919A和C572T突变频率

          作者：李丽帆，李金平，顾国龙

【摘要】  目的： 初步探讨胱硫醚β?合酶（CBS）基因 G919A和C572T位点突变与冠心病（CHD）的关系. 方法： 采用等位基因特异性扩增(ASA)技术对广西64例CHD患者和健康30例健康者进行CBS基因G919A和C572T的检测. 结果： CBS基因G919A两组间基因型以及A等位基因频率分布差异均有统计学意义（P<0.01）. CBS基因C572T两组间基因型以及T等位基因频率分布差异均无统计学意义（P>0.05）. 但G919A 和C572T复合基因型G/A+ C/T型与对照组比较差异有统计学意义（P<0.01）. 结论： 提示CBS G919A突变与广西CHD有重要相关性，而C572T与CHD无明显相关性.

【关键词】  胱硫醚β?合酶（CBS）；冠状动脉疾病；同型半胱氨酸；突变

     0引言

    　　近年来研究表明，高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化一个独立的危险因子［1-3］. 胱硫醚β?合酶（cystathionine β?synthase, CBS）是同型半胱氨酸（homocysteine, Hcy）代谢主要酶之一，国外研究表明CBS基因至少有132个突变点，多个突变点导致高同型半胱氨酸血症，引起冠心病（coronary heart disease, CHD）等疾病. G919A对冠心病发病的影响国内研究报道结果不一. C572T位点突变国内较少报道. 为此，我们以广西冠心病患者为研究对象，了解CBS基因G919A 和C572T位点碱基突变与冠心病关系.

    1对象和方法

    1.1对象广西中医学院附属瑞康收治CHD患者64（男35，女29）例，年龄（70.4±8.7）岁，均为广西地区人. 诊断依据以2002年ACC/AHA不稳定型心绞痛和非ST段抬高性心肌梗死指南和2004年ST段抬高性心肌梗死指南为标准，经临床症状、实验室检查以及冠状动脉造影证实确诊CHD患者. 经医院门诊体检的正常人30（男13，女17）例为对照组，年龄（65.7±8.1）岁，均经询问病史、体格检查和相关实验室检查排除CHD，无其他心脑血管疾病. 清晨空腹取静脉血2 mL，ETDA抗凝，采用酚抽提法提取基因组DNA，8 g/L琼脂糖凝胶电泳检查基因组的完整性，紫外分光光度计检测DNA含量和纯度，TE溶解，-70℃保存备用.  PCR反应试剂购于Promega公司，琼脂糖为Biowest ，溴化已锭购于华美生物工程公司，凝胶成像系统及Quantity One软件、PCR仪为Bio?rad公司. PCR反应引物由由上海生工合成.

    1.2方法

    1.2.1PCR引物反应体系及程序采用等位基因特异性扩增(ASA)技术检测CBS G919A和CBS C572T基因型. G919A引物，野生正向引物（DNA位置9190?9208）5′TACGAGGTGGAAGGGATCG 3′，突变正向引物5′ACGAGGTGGAAGGGATCA′，反向引物(DNA位置9718?9737)5′AACAGCCTCATGGTGGACC 3′. 扩增片段长548 bp. PCR反应体系50 μL，其中含 DNA模板0.2 μg，10 μmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L引物各2 μL，10×PCR缓冲液5 μL，Taq聚合酶1.25 U，25 mmol/L  MgCl2  3 μL. PCR 反应程序：94℃ 2 min，94℃ 30 s→57℃ 30 s→72℃ 1 min 30个循环，72℃ 8 min.   C572T引物，野生正向引物（DNA位置：6696?6714）5′GGGCTGAGATTGTGAGGA C  3′，突变正向引物5′GGGCTGAGATTGTGAGGA T  3′， 反向引物（DNA位置：6995?7012）5′AGATGGACA GAGGGACGC 3′，产物为317 bp ，PCR反应体系同上. 反应程序：95℃ 2 min，95℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 20 s 30个循环，72℃ 7 min.

    1.2.2PCR产物检测PCR产物于15 g/L琼脂糖凝胶，80 V电压下电泳35 min，溴化已锭（EB）染色，以DL2000为DNA Marker,，凝胶成像系统观察带型并照相.

    统计学处理： 用SPSS 11.5软件包处理数据. 计数资料进行χ2检验，并比数比（Odds Ratio, OR）及95%的可信区间(CI),以此来估计基因突变对疾病发生的相关危险度.

    2结果

    2.1CBS基因G919A检测结果（图1）显示，没有A/A型突变出现， CHD组与对照组间G/A, G/G型以及A等位基因频率分布差异有统计学意义（P<0.01，表1）. G919A G/A 基因型对CHD组OR为7.60（95%CI为2.85~20.28 ），与CHD有相关性. 表1两组G919A基因型和等位基因频率分布

    2.2CBS基因C572T检测CHD组CBS基因T/T, T/C, C/C型（图2）及T等位基因型频率分布与对照组比较,差异无统计学意义（P>0.05，表2）. C/T型对CHD组OR为0.50（95%CI为0.099~2.51）, T/T型对CHD组OR为0.95（95%CI为0.90~1.01），提示C572T与CHD无明显相关性.表2两组C572T基因型和等位基因频率分布

    2.3G919A 和C572T复合基因型G/A+C/T型CHD组与对照组间比较差异有统计学意义（P<0.01，表3）. G/A+C/T型对CHD组OR为5.25（95%CI为2.01~13.71），提示G/A+C/T与CHD有相关性. G/A +T/T型CHD组与对照组间比较差异无统计学意义（P>0.05）. G/A+T/T对CHD OR值为0.97（95%CI为0.93~1.01），提示其与CHD无明显相关性.表3CBS G919A与C572T复合突变比较

    3讨论

    　　CBS是Hcy代谢关键酶之一，大量研究表明，血浆Hcy水平与冠心病密切相关［1-4］. 高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia, HHcy）通过损伤血管内皮细胞、刺激血管平滑肌细胞增生、促进血栓形成以及活化炎症因子等途径参与动脉粥样硬化的形成［5-7］，而CBS基因突变引起CBS功能低下是造成HHcy的主要遗传因素之一.

    人CBS基因定位于21号染色体靠近端粒的位置，由23个外显子构成，编码CBS多肽的551个氨基酸残基. G919A位于第8外显子，第919位核苷酸G突变为A，使第307位密码由甘氨酸（G）取代替了丝氨酸（S），导致CBS活性下降. 国外报道［8］，G919A突变多引起重度的HHcy，其基因突变多分布于凯尔特人族同型半胱氨酸尿症患者中，已发现在爱尔兰患者A等位基因频率高达71%，多为严重的HHcy，引起CHD等疾病. 国内关于G919A突变与CHD的关系报道结果不一致，陈欣等［9］对107例GHD组和96例对照组进行CBS基因G919A基因频率分析，结果为GHD组A/A，A/G型频率分布及A、G等位基因频率分布,均与对照组差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01) 而许海燕等［10］对225例GHD组和170例对照组进行CBS基因G919A基因频率分析得出患者组和正常对照组基因型比例之间差异无统计学意义(P>0.05), CBS基因G919A突变与冠心病无明显关系. 所以目前国内外对于CBS基因G919A突变与冠心病的关系还不是很明确. 本研究中，CHD组CBS基因G919A突变明显高于对照组，CHD组G/A型以及A等位基因频率显著高于对照组间（P<0.01），其中携带A等位基因个体患冠心病的风险性为G等位基因的2.85~20.28倍(OR=7.60，95%CI为2.85~20.28 ），提示G919A突变可能是冠心病的危险因素之一.

    　　CBS C572T是继G919A之后的一个高频率突变位点，CBS C572T位点位于编码区第5外显子，第572位C被T替代，使第191位密码原编码的苏氨酸变为蛋氨酸（p.T191M），导致酶活性严重下降，致使同型半胱氨酸代谢障碍，造成高同型半胱氨酸血症，导致CHD. 国外Bermudez等［11］报道，在哥伦比亚高同型半胱氨酸尿症患者中CBS C572T突变［高达70%，而Urreizti等［12］报道高达75%，在西班牙52%和葡萄牙约为33%，而在南美委内瑞拉、阿根廷和巴西突变频率分别为25%，20%和14%［12］. 国外报道［11-12］高同型半胱氨酸尿症主要见于CBS C572T位点突变，这些患者都有HHcy，但是该位点的突变与GHD的关系国外报道甚少. 而且目前国内尚未有CBS C572T相关资料报道. 我们的研究表明，CHD组CBS C572T位点T/T型、C/T型突变频率及T等位基因频率与对照组分别比较，均无统计学意义（P>0.05），OR值为0.97<1，提示CBS C572T可能不是广西CHD发病的独立危险因素.

    　　在CHD组G919A G/A+C572TC/T型复合基因突变频率与对照组比有显著性差异（P<0.01）, G/A+C/T型对CHD的OR值为5.25（95%CI为2.01~13.71），这表明G/A+C/T 型可能与CHD发病有重要相关性，但结合G919A G/A型对CHD的OR值为7.60（95%CI为2.85~20.28），C572T C/T型对CHD的OR值为0.50（95%CI为0.099~2.51）考虑，估计G/A+C/T 型对CHD的危险性可能主要来自G919A G/A突变，C572T C/T型突变对G919A G/A突变可能不足于起协同协同作用，这也反映出基因突变错综复杂性以及对疾病影响的复杂性.

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