CYR61/CCN1在肝细胞肝癌中的原位表达及其临床意义

               作者：丁伟，司维柯，杨景，孙世俊，巫猛，潘静，赵宸   

【摘要】  目的： 观察Cyr61在肝细胞肝癌中表达的意义. 方法： 采用免疫组化法和RT?PCR共检测65例肝细胞肝癌中Cyr61蛋白和mRNA表达水平，分析其表达与肝癌的临床病特征的关系. 结果： 高分化HCC组织的Cyr61蛋白表达水平高于低分化HCC组织(P<0.01)；镜下存在静脉浸润、多结节的HCC组织中Cyr61蛋白表达高于无静脉浸润、单结节的HCC组织(P<0.05). 30例肝癌组织Cyr61 mRNA表达均为阳性，86.67％（26/30）癌组织Cyr61mRNA表达低于相应癌旁组织（P<0.05）. 结论： Cyr61可能在肝癌的发生早期发挥重要作用，并与肝癌进程中的间质重建和侵袭转移有关.

【关键词】  癌，肝细胞；Cyr61/CCN1；免疫组织化学；逆转录聚合酶链反应

    0引言

    富含半胱氨酸61(Cyr61/CCN1)是CCN家族成员之一，为即刻早期基因，广泛存在于人类多种组织器官,如胎盘、心肌、肺、脑、胰腺和结缔组织等,而在胃肠道、前列腺、肝脏、肾脏中其表达相对较低［1］，是重要的细胞基质调节因子. 近来研究发现Cyr61与肿瘤的发生相关，但确切关系和机制尚待阐明. 我们采用免疫组化和RT?PCR方法，分析Cyr61在肝细胞肝癌（HCC）和癌旁组织中的表达，并探讨Cyr61与肝癌发生的关系.

    1材料和方法

    1.1材料2003?12/2005?09 HCC石蜡切片35（男30，女5）例；年龄28~73（平均49.8）岁. 其中高分化22例，低分化13例；结节型肝癌22例中，单结节8例，多结节14例；有镜下静脉浸润15例，无20例. 存在镜下癌栓14例，无21例. 手术切除并经病理确诊的标本30例，男25例，女5例；年龄24~72（平均48.8）岁. 取肿瘤及癌旁肝组织，标本离体后迅速置于液氮中保存. Cyr61多克隆抗体购自Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒SP?9001/9002为北京中杉公司产品. RNA抽提试剂Tripure为Gibco公司产品，逆转录系统试剂Revertra购自Toyobo公司，Cyr61，GAPDH引物均由Invitrogen公司合成，焦碳酸二乙脂 (DEPC)为Sigma公司产品，2xTaq PCR MasterMix 12.5 μL购自天根生物. 1.2方法

    1.2.1Cyr61蛋白检测采用免疫组化SP法. Cyr61工作液由PBS 1∶100稀释. 用0.01 μmol/L枸橼酸钠缓冲液(pH 6.0)热修复方法进行抗原修复. 阴性对照以PBS代替一抗. 山羊链霉素抗生物素? 过氧化酶连接法(SP)试剂盒检测，二氨基联苯胺(DAB)显色. 组织结构及背景清晰，所测组织中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性（+） ，不着色者为阴性(-). 定量测定用NIS?Elements图像分析系统检测所有Cyr61 阳性切片，每张切片选取5 个视野(×400)，且所选区域可以代表整张切片的阳性程度，图像分析系统扫瞄阳性目标1000个/视野以上，测定其阳性细胞的平均吸光度值（MD）代表Cyr61的含量.

    1.2.2Cyr61mRNA检测采用RT?PCR技术，以GAPDH为内参照. 取组织100 mg匀浆后用Tripure提取液提取总RNA. 取部分总RNA用17 g/L的琼脂糖凝胶电泳检查其提取效果，用紫外分光光度计测定260 nm和280 nm的A值，取A260/A280比值为1.8~2.0者用于RT反应. 逆转录合成cDNA. Revertra逆转录系统，根据说明书加入组织总RNA 1  μL建立20 μL反应体系，PCR扩增. Cyr61的上游引物: 5′?ACT TCA TGG TCC CAG TGC GC?3′，下游引物: 5′?AAA TCC GGG TTT CTT TCA CA?3′，产物大小为106 bp，GAPDH上游引物为: 5′?CAT CAC CAT CTT CCA GGA GCG?3′，下游引物: 5′?TGA CCT TGC CCA CAG CCT TG?3′产物大小为443 bp. 反应体系25 μL，包括：灭菌蒸馏水9.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，样品cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，反应条件为94℃预变性5 min，94℃变性45 s，58℃ 45 s, 72℃ 45 s，进行30个循环后，再72℃延伸7 mm.  PCR产物在含有0.8 μg EB的20 g/L琼脂糖凝胶中电泳，以Quantity One 定量分析系统对PCR条带进行分析， Cyr61在肿瘤组织和癌旁组织表达量以相应GAPDH的表达量作为校正，以Cyr61与GAPDH相对光密度的比值为Cyr61在肿瘤组织和癌旁组织的相对表达量.

    统计学处理: Cyr61表达量以x±s表示，应用SPSS 13.0统计软件对组间均值比较，采用t检验. P<0.05表明差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1Cyr61蛋白表达肿瘤组织中Cyr61蛋白表达阳性率为91.4％，主要位于细胞质内. 在细胞间质增生、炎细胞浸润、有散在肝细胞处Cyr61的表达增强（图1）. 高分化肿瘤组织Cyr61表达高于低分化肿瘤组织,且同一肿瘤组织中高分化区域肿瘤细胞Cyr61的表达高于低分化区(P<0.01， 图2). 镜下出现静脉浸润、多结节的HCC组织的Cyr61蛋白表达高于无静脉浸润、单结节的HCC组织的表达量(P<0.05)，高分化HCC组织的Cyr61蛋白表达高于低分化HCC组织的表达量(P<0.01)，但在肿块大小、有无癌栓、AFP浓度、有无转移等方面的差异无统计学意义（表1）.

    A：HCC细胞Cyr61表达阳性，间质中散在肝细胞Cyr61表达强阳性（SP×400）；B：肝癌细胞异形性高，核空泡化；纤维结缔组织增生，炎细胞浸润（HE×400）.

    图1HCC组织中Cyr61的表达

    2.2Cyr61mRNA表达HCC标本和相应癌旁组织均有Cyr61扩增条带，阳性率为100%. 癌组织表达量为0.436±0.198低于相应癌旁组织0.630±0.371（图3）.

    3讨论

    CCN 家族是一组分泌性糖蛋白，与细胞外基质相互作用，调节细胞粘附和移行，促进有丝分裂及细胞分化. 近年来研究表明，Cyr61在多种肿瘤的发生、过程中发挥不同作用. 如Cyr61在乳腺癌、胃腺癌和神经胶质瘤等肿瘤中表达升高，而在子宫内膜癌、非小细胞肺癌等肿瘤中表达却降低［2-4］. 鼻型NK/T 细胞淋巴瘤中Cyr61表达上调可能与肿瘤侵袭性相关［5］. HCC被认为是最恶性的人类肿瘤之一，在的发病率很高,近年来的研究表明，癌基因和A：HCC中Cyr61蛋白的表达(SP×400)；  B：HCC组织（HE×400）.  表1HCC中Cyr61蛋白的表达与临床病理学参数的关系

    抑癌基因在HCC的发生、中发挥关键的作用［6-7］. Cyr61与HCC的关系报道不一，Wang等［8］发现，HCC中Cyr61的表达显著降低,而曾志军等［9］报道HCC组织中，癌旁组织cyr61表达低于癌组织. 我们的结果显示，癌组织中Cyr61mRNA表达量明显低于相应癌旁组织. 结果与Wang等报道一致，与曾志军等报道不一致，这可能与癌旁组织的定义和取样位置不一以及应用的分析方法不同有关. 免疫组化结果还显示，高分化肿瘤组织中Cyr61的表达高于低分化组织，且同一肿瘤组织中高分化区域Cyr61的表达高于低分化区域(P<0.01)，这预示Cyr61可能成为判断肝癌恶性程度的指标. 研究还发现，Cyr61蛋白的表达与肝癌的大小无关，而与结节数目有关，这可能因结节性肝癌中合并肝硬化比例高［10］，Cyr61蛋白的高表达可能促进了HCC组织中基质重构、纤维组织增生和肿瘤血管形成，而后者是肿瘤浸润侵袭的分子生物学基础，并且部分结节可能由肝癌发生肝内转移而形成. 同时发现,HCC中，镜下静脉浸润组Cyr61蛋白表达明显高于无静脉浸润组，提示Cyr61与HCC的侵袭转移密切相关.

    在HCC中，纤维结缔组织增生、炎细胞浸润处Cyr61蛋白表达明显增强，并且同一患者的肝癌组织周围的肝硬化区域Cyr61高表达. 肝癌的发生多经历了肝炎－肝硬化－肝癌的病理过程，肝炎与肝癌有密切、特定的因果关系，而肝硬化又被认为是肝癌的癌前病变形式，故进一步推测Cyr61不但可能是肝癌发生早期的标志物，还可能是肝硬化转化为肝癌的标志物.

【】
  ［1］ Sampath D, Zhu Y, Winneker RC, et al. Aberrant expression of Cyr61, a member of the CCN family ,and dysregulation by 17β?estradiol and basic fibroblast growth factor in human uterine leiomyomas［J］. J Clin End Ocrinol Metab, 2001,86 (4):1707-1715.

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［10］ Zeng ZJ, Yang LY. The expression and significance of Cyr61, CTGF and Nov genes in solttary large hepatocellular carcinoma［J］. Hepatobil Surg, 2006,14:395 -397.